Pouze šarže, která vyhovuje všem požadavkům předepsaným v odstavcích Zkouška totožnosti, Zkoušky na čistotu a Stanovení obsahu může být uvolněna k použití. Pokud byly zkoušky na volný formaldehyd a protimikrobní konzervační látky provedeny v konečné várce vakciny, mohou se u šarže vypustit.
Vlastnosti
Čirá bezbarvá tekutina, prostá viditelných částic.
Zkouška totožnosti
Provede se zkouška totožnosti použitím vhodné imunochemické metody (2.7.1).
Zkoušky na čistotu
Hodnota pH (2.2.3). 6,5 až 7,5.
O-Acetyl skupiny. 0,085 (± 25 %) μmol v dávce (25 μg polysacharidu).
Zkoušený roztok. Do každé ze tří zkumavek se dá po 3 ml vakciny (dva reakční roztoky a jeden korekční roztok).
Porovnávací roztoky. 0,150 g acetylcholiniumchloridu R se rozpustí v 10 ml vody R (základní roztok obsahující 15 g/l acetylcholiniumchloridu). Bezprostředně před použitím se 0,5 ml základního roztoku zředí vodou R na 50 ml (pracovní ředění obsahující 150 μg /ml acetylcholinium chloridu). Do deseti zkumavek se ve dvojicích (reakční a korekční roztok) rozplní 0,1 ml, 0,2 ml, 0,5 ml, 1,0 ml a 1,5 ml pracovního ředění. Slepá zkouška se připraví ze 3 ml vody R.
Objem v každé zkumavce se doplní vodou R na 3 ml. Přidá se 0,5 ml směsi objemových dílů vody R, kyseliny chlorovodíkové zředěné R (1 +2) do každé korekční zkumavky a ke slepé zkoušce. Do každé zkumavky se se přidá 1,0 ml hydroxylamoniumchloridu alkalického RS. Reakce se nechá probíhat přesně 2 min a do každé z reakčních zkumavek se přidá 0,5 ml směsi objemových dílů vody R a kyseliny chlorovodíkové zředěné R (1 + 2). Do každé zkumavky se přidá 0,5 ml roztoku chloridu železitého R (200 g/l) v kyselině chlorovodíkové 2 mol/l RS, zkumavky se zazátkují a silně se protřepají k odstranění bublin.
Měří se absorbance (2.2.25) každého roztoku při 540 nm s použitím slepé zkoušky jako kompenzačního roztoku. Pro každý reakční roztok se odečte absorbance příslušného korekčního roztoku. Sestrojí se kalibrační křivka z absorbancí pěti porovnávacích roztoků a odpovídajících obsahů acetylcholiniumchloridu. Z křivky se odečte obsah acetylcholiniumchloridu ve zkoušených roztocích pro každý zkoušený objem. Vypočítá se průměr ze dvou hodnot.
1 mol acetylcholiniumchloridu (181,7 g) odpovídá 1 mol O-acetylu (43,05 g).
Volný formaldehyd. Vyhovuje zkoušce na volný formaldehyd předepsané v článku Vaccina ad usum humanum.
Protimikrobní konzervační látky. Kde je to vhodné, stanoví se množství protimikrobních konzervačních látek vhodnou fyzikálně-chemickou metodou. Obsah je nejméně minimální účinné množství a nejvýše 115 % deklarovaného množství. Pokud byl při přípravě použit fenol, jeho množství 2,5 g/l (2.5.15).
Sterilita (2.6.1). Vyhovuje zkoušce na sterilitu.
Bakteriální endotoxiny (2.6.14). Nejvýše 3750 m.j. endotoxinu v jednotlivé lidské dávce.
Stanovení obsahu
Vi polysacharid se stanoví vhodnou imunochemickou metodou (2.7.1) s použitím referenčního purifikovaného polysacharidu. Stanovené množství polysacharidu v dávce je 80 % až 120 % deklarovaného množství. Interval spolehlivosti (P = 0,95) stanoveného obsahu je v rozmezí 80 % až 120 %.
Uchovávání
Viz článek Vaccina ad usum humanum.
Označování
Viz článek Vaccina ad usum humanum.
V označení na obale se uvede:
- - počet mikrogramů polysacharidu v lidské dávce (25 μg),
- - celkové množství polysacharidu v obalu.
Vaccinum febris typhoidis vivum perorale (stirpe Ty 21a) 
Živá perorální vakcína proti tyfu (kmen Ty 21a)
Je to lyofilizovaný přípravek živého mikroba Salmonella typhi kmene Ty 21a, vypěstovaného ve vhodné živné půdě. Pokud je vakcína podávána v tobolkách, vyhovuje požadavkům článku Capsulae.
Výroba
Výběr vakcinačního kmene
Hlavní charakteristikou kmene je nedostatek enzymu uridin difosfat-galaktosa-4-epimerasy. Aktivita galaktopermeasy, galaktokinasy a galaktosa-1-fosfat uridyl-transferasy jsou sníženy o 50 % až 90 %. Kmen neobsahuje Vi antigen, i když jsou růstové podmínky jakékoli. Sérum anti-O:9 aglutinuje kmen pouze tehdy, pěstuje-li se na půdě s obsahem galaktosy. Obsahuje bičíkový H:d antigen a netvoří sirovodík na Kliglerově agaru s obsahem železa. Kmen není virulentní pro myši. Buňky kmene Ty 21a lyzují, pokud se pěstují v přítomnosti 1 % galaktosy.
Bakteriální inokula
K přípravě vakcíny se používá systém jednotné inokulace. Pracovní inokula jsou nanejvýš první subkulturou matečného inokula. Konečná vakcína představuje nanejvýš čtvrtou subkulturu původní vakcíny, se kterou byly provedeny laboratorní a klinické zkoušky prokazující vhodnost kmene.
Pro přípravu pracovního inokula se použije pouze takové matečné inokulum, které vyhovuje následujícím požadavkům.
Galaktosový metabolismus. Stanoví se spektrofotometricky; v cytoplazmě kmene Ty 21a není zjištěna žádná aktivita enzymu uridin difosfat-galaktosa-4-epimerasy.
Biosyntéza lipopolysacharidů. Lipopolysacharidy se extrahují metodou fenol-voda za tepla a zkoušejí chromatografií na molekulárním sítu. Kmen Ty 21a pěstovaný na půdě bez galaktosy vykazuje pouze přítomnost R typu lipopolysacharidu.
Sérologické charakteristiky. Kmen Ty 21a pěstovaný na syntetické půdě bez galaktosy se neaglutinuje specifickým anti-O:9 sérem. Vi antisérem se kmen Ty 21a neaglutinuje nikdy, bez ohledu na růstové podmínky. Kmen Ty 21a se aglutinuje H:d bičíkovým antisérem.
Biochemické markery. Kmen Ty 21a netvoří na Kliglerově agaru s obsahem železa sirovodík. Tato vlastnost slouží k jeho odlišení od ostatních galaktosa-epimerasa-negativních kmenů S. typhi.
Buněčný růst. Kmen Ty 21a lyzuje, když roste v přítomnosti 1 % galaktosy.
Množení a získávání bakterií
Bakterie z pracovního inokula se pomnoží v prekultuře, připraví se jedna subkultura a pak se při 30 °C pěstují 13 h až 15 h ve vhodné půdě obsahující 0,001 % galaktosy. Bakterie se sklidí tak, aby nedošlo ke kontaminaci jinými mikroorganismy.
K přípravě lyofilizované sklizně lze použít pouze takové jednotlivé sklizně, které vyhovují následujícím požadavkům.
Hodnota pH. 6,8 až 7,5; měří se kultura.
Optická hustota. 6,5 až 11,0; měřeno při 546 nm. Před měřením se kultura naředí tak, aby se naměřená hodnota pohybovala mezi 0,1 a 0,5 a podle ředění se pak skutečná hustota vypočítá.
Zkouška totožnosti. Bakterie se pěstují na agarové půdě obsahující 1 % galaktosy a modř bromthymolovou. Vytvoří se světle modré, konkávní, vzhledem k lýze buněk průhledné kolonie. Neobjeví se žádné žluté (galaktosu fermentující) kolonie.
Lyofllizovaná sklizeň
Sklizeň se smíchá s vhodným stabilizátorem a lyofilizuje postupem zaručujícím přežití nejméně 10 % bakterií a na takový obsah vody, který je prokazatelně vhodný pro stabilitu vakcíny. K vakcíně se nepřidává žádná protimikrobní konzervační látka.
K přípravě konečné várky vakcíny se použije pouze taková lyofllizovaná sklizeň, která vyhovuje následujícím požadavkům.
Zkouška totožnosti. Bakterie se pěstují na agarové půdě obsahující 1 % galaktosy a modř bromthymolovou. Vytvoří se světle modré, konkávní, vzhledem k lýze buněk průhledné kolonie. Neobjeví se žádné žluté (galaktosu fermentující) kolonie.
Počet živých bakterií. Nejméně 1 . 1011 živých mikrobů S. typhi kmene Ty 21a v gramu.
Voda, semimikrostanovení (2.5.12). 1,5 % až 4,0 %.
Konečná várka vakcíny
Konečná várka vakcíny se připraví aseptickým smícháním jedné nebo více lyofilizovaných sklizní s vhodným sterilním vehikulem.
K přípravě šarže se použije pouze taková konečná várka vakcíny, která vyhovuje následujícímu požadavku.
Počet živých bakterií. Nejméně 40 . 109 živých mikrobů S.typhi kmene Ty 21a v gramu.
Šarže
Konečná várka vakcíny se rozplní za aseptických podmínek do kapslí se stěnou odolnou proti žaludeční šťávě nebo do jiných vhodných obalů.
K použití se uvolní pouze šarže, která vyhovuje požadavkům dále uvedeným v odstavcích Zkouška totožnosti, Zkoušky na čistotu a Počet živých bakterií. Výjimkou je požadovaná hodnota počtu živých bakterií, která je nejméně 4 . 109 živých bakterií v dávce.
Zkouška totožnosti
Bakterie ze zkoušeného přípravku se pěstují na agarové půdě obsahující 1 % galaktosy a modř bromthymolovou. Vytvoří se světle modré, konkávní, vzhledem k lýze buněk průhledné kolonie. Neobjeví se žádné žluté (galaktosu fermentující) kolonie.
Zkoušky na čistotu
Cizí mikroorganismy (2.6.12, 2.6.13). Zkouška se provede na vhodných selektivních půdách. Plotnovou metodou se stanoví celkový počet živých mikroorganismů. Počet cizích mikroorganismů v jedné dávce není větší než 10 bakterií a 20 hub. Není nalezen žádný patogenní mikroorganismus, zvláště Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa ani salmonela jiného kmene než Ty 21a.
Voda, semimikrostanovení (2.5.12). 1,5 % až 4,0 %; stanoví se z obsahu jedné tobolky nebo obalu.
Stanovení počtu živých bakterií
Ke zkoušce se použije nejméně pět dávek. Obsah jednotlivých dávek se v chladném prostředí zhomogenizuje při 4 °C v roztoku chloridu sodného R (9 g/l) za použití mixéru a tolika skleněných kuliček, aby vyčnívaly z tekutiny. Ihned po homogenizaci se připraví vhodné ředění suspenze ve vychlazeném rozpouštědle a očkuje se na agar s přísadou mozkosrdcové infuze. Inkubuje se 20 h až 36 h při (36 ± 1) °C. Zkoušený přípravek obsahuje v jedné dávce nejméně 2 .109živých mikrobů S. typhi Ty 21a.
Uchovávání
Viz článek Vaccina ad usum humanum.
Označování
Viz článek Vaccina ad usum humanum.
V označení na obalu se uvede:
- - minimální množství živých bakterií v jedné dávce,
- - že vakcína je pouze pro perorální použití.
Vaccinum hepatitidis A inactivatum
Inaktivovaná vakcína proti hepatitidě A
Je to tekutý přípravek z vhodného kmene viru hepatitidy A pomnoženého v buněčných kulturách a inaktivovaného validovanou metodou. Vakcína je opalescentní suspenze.
Vakcína vyhovuje článku Vaccina ad usum humanum.
Výroba
Výroba vakcíny je založena na systému jednotné inokulace a na systému buněčné banky. Výrobní metoda prokazatelně poskytuje stejnorodou vakcínu, která vyhovuje požadavkům na imunogenitu, neškodnost a stabilitu.
Výrobní metoda se validuje, aby se prokázalo, že přípravek, bude-li zkoušen, vyhoví zkoušce neškodnosti pro imunní séra a humánní vakcíny (2.6.9).
Pokud není doloženo a schváleno jinak, virus v konečném přípravku neprojde více pasážemi z matečného inokula než virus použitý k přípravě vakcíny, která vyhověla v klinických studiích z hlediska neškodnosti a účinnosti.
Referenční přípravek. Část šarže, která byla prokazatelně nejméně tak imunogenní jako šarže, jež v klinické studii na mladých zdravých dospělých vykazovala nejméně 95% sérokonverzi, odpovídající hladině neutralizačních protilátek považované za ochrannou po úplné primární imunizaci, se používá jako referenční přípravek. Jako ochranná hladina protilátek se uznává 0,02 m.j./ml, stanoveno metodou ELISA.
Substrát pro pomnožování viru
Virus se pomnožuje v linii lidských diploidních buněk (5.2.3) nebo v kontinuální linii buněk schválené oprávněnou autoritou.
Inokula
Kmen viru hepatitidy A, který se používá k přípravě matečného inokula, se identifikuje vývojovými záznamy, které obsahují informace o původu kmene a o následné manipulaci s ním.
Pouze virus, který odpovídá následujícím požadavkům, se může použít pro pomnožování.
Zkouška totožnosti. Každé matečné a pracovní inokulum viru se identifikuje jako virus hepatitidy A pomocí specifických protilátek.
Koncentrace viru. K zajištění stejnorodosti výroby se stanoví koncentrace viru v matečném a pracovním inokulu.
Cizí agens. Matečná a pracovní inokula vyhovují požadavkům na inokula pro virové vakcíny (2.6.16). Jestliže byla pro izolaci virového kmene použita kultura primárních opičích buněk, provedou se navíc opatření, aby se zajistilo, že kmen není kontaminován opičími viry, jako jsou virus opičí imunodeficience, Ebola virus a Marburg virus.
Pomnožování viru a sklizeň
Veškeré činnosti s buněčnou bankou a následnými buněčnými kulturami se provádějí za aseptických podmínek v prostorách, kde nejsou zpracovávány jiné buňky. Při přípravě média pro kultivaci buněk se používá schválené sérum zvířecího (nikoli lidského) původu. Sérum a trypsin používané při přípravě buněčné suspenze a médií jsou prokazatelně prosty cizích agens: trypsin vyhovuje článku Trypsinum. Médium pro kultivaci buněk může obsahovat indikátor pH, jako je fenolová červeň, a schválená antibiotika v nejnižší účinné koncentraci. Nejméně 500 ml buněčných kultur použitých pro výrobu vakcíny se ponechá jako neinfikované buněčné kultury (kontrolní buňky). Několikanásobné sklizně z téže buněčné produkční kultury se mohou spojit a považovat za jednotlivou sklizeň.
Pouze jednotlivá sklizeň vyhovující následujícím požadavkům se může použít k přípravě vakcíny. Jestliže stanovení poměru virové koncentrace k obsahu antigenu provedené na vhodném počtu sklizní prokazuje pravidelnost výroby, může se tato zkouška následně vypustit při rutinní kontrole.
Zkouška totožnosti. Zkouška na obsah antigenu slouží také jako zkouška totožnosti jednotlivé sklizně.
Bakterie a houby (2.6.1). Jednotlivá sklizeň vyhovuje ve zkoušce na sterilitu; na každou živnou půdu se použije 10 ml.
Mykoplazmata (2.6.7). Jednotlivá sklizeň vyhovuje zkoušce na mykoplazmata; na každou půdu se použije 1 ml.
Kontrolní buňky. Kontrolní buňky z kultur produkčních buněk vyhovují zkoušce totožnosti a požadavkům na cizí agens (2.6.16).
Obsah antigenu. Stanoví se obsah antigenu hepatitidy A vhodnou imunochemickou metodou (2.7.1) ke sledování pravidelnosti výroby; obsah je v rozmezí schváleném pro jednotlivý přípravek.
Poměr koncentrace viru k obsahu antigenu. Stálost poměru koncentrace infekčního viru, stanoveného vhodnou metodou na buněčné kultuře, k obsahu antigenu je stanoven validací na vhodném počtu jednotlivých sklizní.
Purifikace a purifikovaná sklizeň
Sklizeň, která může být spojením několika jednotlivých sklizní, se purifikuje validovanými metodami. Jsou-li pro pomnožení viru použity kontinuální buněčné linie, purifikační proces prokazatelně zahrnuje také důsledné snížení hladiny DNK hostitelských buněk.
Pouze purifikovaná sklizeň, která vyhovuje následujícím požadavkům, může být použita k přípravě inaktivované sklizně.
Koncentrace viru. Koncentrace infekčního viru v purifikované sklizni se stanoví na vhodné tkáňové kultuře ke sledování pravidelnosti výroby a jako počáteční bod pro sledování inaktivační křivky.
Poměr antigenu k celkové bílkovině. Stanoví se obsah antigenu viru hepatitidy A vhodnou imunochemickou metodou (2.7.1). Stanoví se obsah celkové bílkoviny validovanou metodou. Poměr obsahu antigenu viru hepatitidy A k obsahu celkové bílkoviny je v rozmezí schváleném pro jednotlivý přípravek.
Bovinní sérumalbumin. Nejvýše 50 ng v ekvivalentu jedné lidské dávky, stanoveno vhodnou imunochemickou metodou (2.7.1). Jestliže to dovolí výrobní proces, lze použít jiné vhodné bílkovinné markery k průkazu účinné purifikace.
Zbytková DNK hostitelských buněk. Je-li pro pomnožení viru použita kontinuální buněčná linie, obsah zbytkové DNK hostitelských buněk, stanovený vhodnou imunochemickou metodou, jak je popsáno v článku Producta ab ADN recombinante, je nejvýše 100 pg v ekvivalentu jedné lidské dávky.
Zbytky chemikálií. Pokud se při purifikačních postupech používají chemické látky, provedou se na purifikované sklizni (nebo na inaktivované sklizni) zkoušky na tyto látky, pokud validace postupu neprokáže úplné odstranění. Koncentrace nepřesahuje rozmezí schválené pro jednotlivý přípravek.
Inaktivace a inaktivovaná sklizeň
Několik purifikovaných sklizní se může spojit před inaktivací. K zamezení interference v inaktivačním procesu se předchází tvorbě virových agregátů nebo se virové agregáty odstraňují bezprostředně před nebo během inaktivačního postupu. Virová suspenze se inaktivuje validovanou metodou; metoda je prokazatelně schopna stejnoměrně inaktivovat virus hepatitidy A bez poškození antigenní a imunogenní aktivity; jako část validační studie je nakreslena inaktivační křivka reprezentující koncentraci zbytkového živého viru měřenou nejméně třikrát (např. ve dni 0, 1 a 2 inaktivačního postupu). Při použití formaldehydu k inaktivaci se přítomnost zbytků volného formaldehydu stanovuje na konci inaktivačního procesu.
Pouze inaktivovaná sklizeň, která vyhovuje následujícím požadavkům, se může použít pro přípravu konečné várky vakcíny.
Inaktivace. Provede se pomnožovací zkouška na přítomnost zbytků infekčního viru hepatitidy A inokulací určitého množství inaktivované sklizně, odpovídající 5 % šarže, ale nejvýše 1500 dávek vakcíny do buněčných kultur téhož typu, který byl použit pro přípravu vakcíny. Po dvou pasážích se provede zkouška vhodné citlivosti na přítomnost zbytkového infekčního viru. Ve vzorcích odebraných na konci inaktivace se nenaleznou známky pomnožení viru hepatitidy A. Jako pozitivní kontrola se souběžně použije infekční virus k prokázání vnímavosti buněk a nepřítomnosti interference.
Sterilita. (2.6.1). Inaktivovaná virová sklizeň vyhovuje zkoušce na sterilitu; na každou živnou půdu se použije 10 ml.
Bakteriální endotoxiny (2.6.14). Jestliže se v konečném výrobku nemůže provést validní test na bakteriální endotoxiny, např. pro přítomnost adjuvans, provede se zkouška v inaktivované sklizni. Obsahuje nejvýše 2 m.j. endotoxinu v ekvivalentu jedné lidské dávky.
Obsah antigenu. Vhodnou imunochemickou metodou se stanoví obsah antigenu viru hepatitidy A (2.7.1).
Zbytky chemikálií. Pokud se při purifikačních postupech používají chemické látky, provedou se na inaktivované sklizni (nebo na purifikované sklizni) zkoušky na tyto látky, pokud validace postupu neprokáže úplné odstranění. Koncentrace nepřesahuje rozmezí schválené pro jednotlivý přípravek.
Konečná várka vakcíny
Konečná várka vakciny se připraví z jedné nebo více inaktivovaných sklizní. Mohou se přidat schválená adjuvans, stabilizátory a protimikrobní konzervační látky.
Pouze taková konečná várka vakcíny, která vyhovuje následujícím požadavkům, se může použít k přípravě šarže.
Sterilita. (2.6.1). Konečná várka vakciny vyhovuje ve zkoušce na sterilitu; na každou živnou půdu se použije 10 ml.
Protimikrobní konzervační látky. Při jejich použití se stanoví množství protimikrobních konzervačních látek vhodnou chemickou nebo fyzikálně-chemickou metodou. Množství je 85 % až 115 % zamýšleného množství.
Šarže
Konečná várka vakciny se asepticky rozplní do sterilních obalů. Obaly se potom uzavřou tak, aby se předešlo kontaminaci.
Pouze šarže, která vyhovuje všem požadavkům uvedeným dále v odstavcích Zkoušky totožnosti, Zkoušky na čistotu a Stanovení účinnosti se může uvolnit k použití. Za předpokladu, že zkouška na volný formaldehyd (přichází-li v úvahu) a stanovení obsahu protimikrobních konzervačních látek (přichází-li v úvahu) a stanovení účinnosti byly provedeny v konečné várce vakcín s vyhovujícími výsledky, lze je u šarže vypustit.
Zkoušky totožnosti
Obsah antigenu viru hepatitidy A ve vakcíně se prokáže vhodnou imunochemickou metodou (2.7.1) za použití specifických protilátek nebo zkouškou imunogenity na myších, popsanou v odstavci Stanovení účinnosti.
Zkoušky na čistotu
Hliník. Jestliže byl použit jako adsorbent hydratovaný fosforečnan hlinitý nebo hydroxid hlinitý, vyhovuje vakcína zkoušce předepsané v článku Vaccina ad usum humanum.
Volný formaldehyd. Při použití formaldehydu pro inaktivaci vyhovuje vakcína zkoušce předepsané v článku Vaccina ad usum humanum.
Protimikrobní konzervační látky. Při jejich použití se stanoví jejich množství vhodnou chemickou nebo fyzikálně-chemickou metodou. Množství není nižší než nejnižší prokazatelně účinné množství a vyšší než 115 % množství uvedeného v označení.
Sterilita (2.6.1). Vakcína vyhovuje zkoušce na sterilitu.
Bakteriální endotoxiny (2.6.14). Nejvýše 2 m.j. endotoxinu v jedné lidské dávce. Nelze-li provést validovanou zkoušku s konečnou šarží, např. pro přítomnost adjuvans, provede se zkouška s inaktivovanou sklizní.
Stanovení účinnosti
Buďto se účinnost vakciny stanoví porovnáním množství nezbytného k vytvoření specifických protilátek u myší s množstvím referenčního přípravku potřebným k vyvolání téhož účinku, nebo se provede validované stanovení obsahu antigenu in vitro.
Zkouška na myších uvedená dále je příkladem metody, která byla shledána vhodnou pro danou vakcínu; mohou se použít i jiné validované metody.
Požadavek na účinnost. Horní mez spolehlivosti (P = 0,95) stanovené relativní účinnosti je nejméně 1,0.
Výběr a rozdělení zkoušených zvířat. Použijí se zdravé myši z jednoho chovu, staré 5 týdnů a prokazatelně vhodného kmene. Používají se zvířata téhož pohlaví. Zvířata se rozdělí do nejméně sedmi stejných skupin o počtech vhodných pro požadavky zkoušky.
Stanovení účinnosti zkoušené vakcíny. K ředění se použije roztok chloridu sodného R (9 g/l) obsahující hliníkové adjuvans použité pro vakcínu. Připraví se nejméně tři ředění zkoušené vakcíny a referenčního přípravku. Každému zvířeti ve skupině se subkutánně vstříkne nejvýše 1,0 ml ředění určeného pro skupinu. Kontrolní skupině neočkovaných zvířat se subkutánně vstříkne stejné množství výše uvedeného roztoku k ředění. Po 28 až 32 dnech se zvířatům podá anestezie, vykrvácejí se a jednotlivá séra se zpracují odděleně. V jednotlivých sérech se vhodnou imunochemickou metodou (2.7.1) stanoví obsah specifických protilátek proti hepatitidě A.
Výpočet. Výpočet se provede obvyklými statistickými metodami pro zkoušky s kvantitativní odpovědí (např. 5.3 Statistické hodnocení výsledků biologických zkoušek, sekce 4).
Podle rozložení reakčních hladin naměřených ve všech sérech nevakcinované skupiny se stanoví maximální reakční hladina, kterou lze nalézt u nevakcinovaných zvířat pro tuto zvláštní zkoušku. Odpověď ve vakcinovaných skupinách, která přesahuje tuto hladinu, je definována jako sérokonverze.
Provede se vhodná transformace na procentové vyjádření zvířat vykazujících sérokonverzi v každé skupině (např. probitová transformace) a provede se analýza dat podle rovnoběžného modelu log dávky - odpověď. Stanoví se účinnost zkoušeného přípravku ve vztahu k referenčnímu přípravku.
Validační podmínky. Zkoušku lze hodnotit, jestliže:
- - pro zkoušenou i referenční vakcínu leží ED50 mezi nejnižší a nejvyšší dávkou podanou zvířatům,
- - statistická analýza nevykazuje signifikantní odchylku od linearity nebo rovnoběžnosti,
- - předpokládané limity odhadované relativní účinnosti leží mezi 33 % a 300 % stanovené účinnosti.
Uchovávání
Viz článek Vaccina ad usum humanum.
Označování
Viz článek Vaccina ad usum humanum.
V označení na obalu se uvede biologický původ buněk a adjuvans použité pro přípravu vakcíny.
Vaccinum hepatitidis B (ADNr)
Vakcína proti hepatitidě B (rDNK) rekombinantní
Je to přípravek z povrchového antigenu viru hepatitidy B, základního proteinu viru hepatitidy B. Tento antigen se získává rekombinantní DNK technologií.
Přípravek vyhovovuje požadavkům článků Producta ab ADN recombinante a Vaccina ad usum humanum.
Výroba
Viz článek Producta ab ADN recombinante, zvláště v částech Klonování a exprese, Systém buněčných bank, Validace buněčných bank, Validace výrobního postupu a Pravidelnost výroby.
Přípravek prokazatelně podněcuje tvorbu specifických ochranných protilátek u člověka. Výrobní metoda prokazatelně poskytuje stále vakcínu, která vyhovuje požadavkům na imunogenitu a neškodnost.
Výrobní postup se validuje, aby se prokázalo, že pokud bude přípravek zkoušen, vyhoví zkoušce na neškodnost imunních sér a vakcín pro humánní použití (2.6.9)
Přípravek se vyrábí expresí virového genu kódujícího povrchový antigen viru hepatitidy B (HBsAg) v kvasinkách (Saccharomyces cerevisiae) nebo v savčích buňkách (buňky ovaria čínského křečka nebo jiných vhodných buněčných linií) purifikací výsledného HBsAg a převedením tohoto antigenu do imunogenního přípravku. Vhodnost a neškodnost buněk schvaluje oprávněná autorita.
Přípravek může obsahovat produkt S genu (hlavní bílkovina), kombinaci S genového a pre-S2 genového produktu (střední bílkovina), nebo kombinaci S genového, pre-S2 genového a pre-S1 genového produktu (velká bílkovina).
Referenční přípravek. Jako referenční přípravek se používá část šarže reprezentující šarži vakcíny, která v klinické studii na mladých zdravých dospělých jedincích prokazatelně vykazuje nejméně 95% sérokonverzi (HBsAg protilátkový titr je větší než 10 m.j. v litru po úplné primární imunizaci).
Charakteristika látky
K charakteristice antigenu se provede vývojová studie, ve které se určí jeho úplná bílkovinná, lipidová a sacharidová struktura. Morfologické charakteristiky antigenních částic se stanoví elektronovou mikroskopií. Vhodná denzita antigenních částic se stanoví fyzikálně-chemickými metodami, např. gradientovou centrifugací Charakterizují se antigenní epitopy. Bílkovinná frakce antigenu se charakterizuje primární strukturou (např. stanovením aminokyselinového složení, částečnou analýzou aminokyselinové sekvence a mapováním peptidů).
Kultura a sklizeň
Totožnost, mikrobiologická čistota, plazmidová retence a konzistence sklizně jsou určeny vhodným výrobním uspořádáním. Jestliže jsou použity savčí buňky, provedou se zkoušky na cizí antigeny a mykoplazmata podle stati Důkaz cizích antigenů v lidských virových vakcínách (2.6.16).
Přečištěný antigen
Pro přípravu konečné várky se použije pouze přečištěný antigen, který odpovídá následujícím požadavkům.
Celková bílkovina. Stanoví se validovanou metodou. Obsah je v rozmezí schváleném pro specifický přípravek.
Totožnost a obsah antigenu. Množství a specificita HBsAg se stanoví porovnáním s mezinárodním standardem HBsAg subtypu ad nebo s národním referenčním přípravkem za pomoci vhodné imunochemické metody (2.7.1), jako je radioimunoanalýza, enzymové imunosorbentové stanovení (ELISA), imunoblot (přednostně se užívají monoklonální protilátky přímo proti protektivnímu epitopu), nebo jednoduchou radiální difuzí. Poměr antigenu k bílkovině je v rozmezí schváleném pro specifický přípravek. Molekulová hmotnost v hlavním pásu zjištěná elektroforézou na polyakrylamidovém gelu s dodecylsíranem sodným (SDS-PAGE) za redukovaných podmínek odpovídá očekávané hodnotě z genové sekvence a možné glykosylace.
Čistota antigenu. Stanoví se srovnáním s referenčním přípravkem za použití kapalinové chromatografie nebo jiné vhodné metody, jako je SDS-PAGE s barvením modří kyselou 92 a stříbrem.
Vhodná metoda musí být dost citlivá k detekci možného znečištění v koncentraci 1 % celkové bílkoviny. Nejméně 95 % celkové bílkoviny tvoří povrchový antigen hepatitidy B.
Složení. Stanoví se obsah bílkovin, lipidů, nukleových kyselin a sacharidů.
DNK hostitelských buněk a vektorem derivovaná DNK. Nejvýše 10 pg DNK v množství přečištěného antigenu odpovídajícím jedné lidské dávce vakcíny. Stanoví se u přípravků vyrobených pomocí savčích buněk.
Cesium. Jestliže se při výrobě použijí cesiové soli, provede se v přečištěném antigenu stanovení zbytků cesia. Obsah je v rozmezí schváleném pro specifický přípravek.
Sterilita (2.6.1). Přečištěný antigen vyhovuje zkoušce na sterilitu. Na každou živnou půdu se použije 10 ml.
Další zkoušky se mohou u přečištěného antigenu požadovat v závislosti na použité výrobní metodě: např. stanovení zbytků zvířecího séra, jestliže byly pro výrobu použity savčí buňky, nebo zkoušky na zbytky chemikálií používaných při extrakci a čištění.
Konečná várka vakcíny
Vakcína může obsahovat protimikrobní konzervační látku a adjuvans.
Pouze várka, která vyhovuje následujícím požadavkům, se může použít pro přípravu šarže.
Protimikrobní konzervační látky. Kde jsou použity, stanoví se jejich obsah vhodnou chemickou nebo fyzikálně-chemickou metodou. Obsah je v rozmezí 85 % až 115 % deklarovaného množství.
Sterilita (2.6.1). Vyhovuje zkoušce na sterilitu. Na každou živnou půdu se použije 10 ml konečné várky.