Český lékopis 1997

Ztráta sušením (2.2.32). Nejvýše 3,5 %; 1,00 g se suší 3 h při 60 °C nad oxidem fosforečným R při tlaku nepřevyšujícím 670 Pa.

Síranový popel (2.4.14). Nejvýše 1,0 %; stanoví se s 1,0 g zkoušené látky.

Sírany. 16,0 % až 18,0 %, počítáno na vysušenou látku. 0,250 g se rozpustí ve 100 ml vody R a pH roztoku se upraví amoniakem 26% R na 11. Přidá se 10 ml chloridu barnatého 0,1 mol/l RS a asi 0,5 mg červeně ftaleinové R. Titruje se chelatonem 0,1 mol/l VS, a jakmile se začne měnit barva roztoku, přidá se 50 ml lihu 96% R a pokračuje se v titraci až do vymizení fialově modré barvy.

1 ml chloridu barnatého 0,1 mol/l VS odpovídá 9,606 mg síranů (SO₄).

Stanovení účinnosti

Provede se mikrobiologické stanovení účinnosti antibiotik (2.7.2).

Uchovávání

Ve vzduchotěsných obalech, chráněn před světlem.

Separandum.

Copovidonum

Kopovidon

Synonymum. Copolyvidonum

Vlastnosti

Bílý nebo nažloutle bílý hygroskopický prášek nebo vločky. Je snadno rozpustný ve vodě, v lihu 96% a v dichlormethanu, prakticky nerozpustný v etheru.

Zkoušky totožnosti

Základní sestava zkoušek: A.

Alternativní sestava zkoušek: B a C, viz Obecné zásady (1.2).

1. A. Infračervené absorpční spektrum (2.2.24) zkoušené látky se shoduje s referenčním spektrem Ph. Eur. kopovidonu.
2. B. K 1 ml roztoku S, viz Zkoušky na čistotu, se přidá 5 ml vody R a 0,2 ml jodu 0,05 mol/l VS; vznikne červené zbarvení.
3. C. 0,7 g hydroxylamoniumchloridu R se rozpustí v 10 ml methanolu R, přidá se 20 ml hydroxidu sodného 1 mol/l VS a v případě potřeby se zfiltruje. K 5 ml roztoku se přidá 0,1 g zkoušené látky a 2 min se vaří. 0,05 ml se přenese na filtrační papír a přidá se 0,1 ml směsi stejných objemových dílů chloridu železitého RS1 a kyseliny chlorovodíkové R; vznikne fialové zbarvení.

Zkoušky na čistotu

Roztok S. 10 g se rozpustí ve vodě R a zředí se jí na 100 ml. Zkoušená látka se přidává do vody R po malých dávkách za stálého míchání.

Vzhled roztoku. Roztok S neopalizuje intenzivněji než porovnávací suspenze III (2.2.1) a není zbarven intenzivněji než porovnávací barevný roztok H₅, Č₅ nebo HŽ₅ (2.2.2, Metoda II).

Aldehydy. K 20,0 g se do kuželové baňky se zabroušenou zátkou přidá 180 ml vody R, vaří se 45 min pod zpětným chladičem a nechá se ochladit. Roztok se destiluje a asi 60 ml destilátu se jímá do 20,0 ml roztoku hydroxylamoniumchloridu R (70 g/l) chlazeného ve vodě s ledem a s předem upraveným pH na hodnotu 3,1 hydroxidem sodným 1 mol/l RS. Titruje se hydroxidem sodným 0,1 mol/l VS. K dosažení pH 3,1 se spotřebuje nejvýše 9,1 ml hydroxidu sodného 0,1 mol/l VS (0,2 % vyjádřeno jako acetaldehyd). Provede se slepá zkouška.

Peroxidy. 10 ml roztoku S se zředí vodou R na 25 ml, přidají se 2 ml zkoumadla chlorid titanitý-kyselina sírová R a nechá se 30 min stát. Měří se absorbance (2.2.25) tohoto roztoku při 405 nm za použití směsi 25 ml roztoku zkoušené látky (40 g/l) a 2 ml roztoku kyseliny sírové R 13% (V/V) jako kontrolní tekutiny. Absorbance není větší než 0,35 (400 μg/g, vyjádřeno jako H₂O₂).

Hydrazin. Provede se tenkovrstvá chromatografie (2.2.27) za použití vrstvy silikagelu H silanizovaného R. Použijí se čerstvě připravené roztoky.

Zkoušený roztok. K 25 ml roztoku S se přidá 0,5 ml roztoku salicylaldehydu R (50 g/l) v methanolu R, promíchá se a zahřívá 15 min ve vodní lázni při 60 °C. Po ochlazení se přidají 2,0 ml xylenu R, 2 min se protřepává a odstředí se. Použije se čirý supernatant.

Porovnávací roztok. 9 mg salicylaldazinu R se rozpustí v xylenu R a zředí se jím na 100 ml. 1 ml tohoto roztoku se zředí xylenem R na 10 ml.

Na vrstvu se nanese odděleně 10 μl obou roztoků a vyvíjí se směsí objemových dílů vody R a methanolu R (20 + 80) po dráze 15 cm. Vrstva se usuší volně na vzduchu a pozoruje se v ultrafialovém světle při 365 nm. Na chromatogramu zkoušeného roztoku skvrna odpovídající salicylaldazinu není intenzivnější než skvrna na chromatogramu porovnávacího roztoku (1 μg/g hydrazinu).

Monomery. 5,0 g se rozpustí v 15 ml methanolu R, pomalu se přidá 20,0 ml bromidu jodného RS a nechá se 30 min stát chráněn před světlem za občasného promíchání. Přidá se 10 ml roztoku jodidu draselného R (100 g/l) a titruje se thiosíranem sodným 0,1 mol/l VS do vzniku žlutého zbarvení a v titraci se po kapkách pokračuje do odbarvení. Provede se slepá zkouška. Spotřeba thiosíranu sodného 0,1 mol/l VS je nejvýše 3,6 ml (0,4 %).

Těžké kovy (2.4.8). 2 g vyhovují limitní zkoušce D na těžké kovy (10 μg/g). Porovnávací roztok se připraví za použití 2,0 ml základního roztoku olova (10 μg Pb/ml).

Ztráta sušením (2.2.32). Nejvýše 5,0 %; 0,500 g se suší v sušárně při 100 °C až 105 °C.

Síranový popel (2.4.14). Nejvýše 0,1 %; stanoví se s 1,00 g zkoušené látky.

K-hodnota. 5,0 ml roztoku S se zředí vodou R na 50,0 ml, nechá se 1 h stát a stanoví se viskozita (2.2.9) při (25 ± 0,1) °C za použití viskozimetru č. 1 s minimální dobou průtoku 100 s.

K-hodnota se vypočítá podle vzorce:

v němž značí:

1. c - obsah zkoušené látky v procentech (g/100 ml), počítáno na vysušenou látku,
2. η - relativní viskozitu roztoku.

Stanovení obsahu

Dusík. Provede se stanovení obsahu dusíku (2.5.9) s 30,0 mg zkoušené látky a s 1 g směsi 997 dílů síranu draselného R a 3 dílů síranu měďnatého R. Žíhá se ještě 45 min po vzniku čiré světle zelené tekutiny.

Vinylacetatová složka. Stanoví se číslo zmýdelnění (2.5.6) s 2,00 g zkoušené látky. Výsledek se násobí číslem 0,1534 a získá se obsah vinylacetatové složky vyjádřený v procentech.

Uchovávání

Chráněn před vlhkostí.

Označování

V označení na obalu se uvede K-hodnota.

Coriandri etheroleum

Koriandrová silice

Synonyma. Coriandri aetheroleum, Oleum coriandri

Je to silice získaná ze zralých plodů druhu Coriandrum sativum L. destilací s vodní parou. Obsahuje 60,0 % až 85,0 % volných i vázaných alkoholů, počítáno jako linalol (C₁₀H₁₈O; M_r 154,25).

Vlastnosti

Bezbarvá až slabě nažloutlá čirá kapalina, charakteristického pachu a chuti. Je velmi těžce rozpustná ve vodě, mísitelná s ethanolem, s etherem a s mastnými oleji.

Zkoušky totožnosti

Provede se tenkovrstvá chromatografie (2.2.27) za použití vrstvy silikagelu G R.

Zkoušený roztok. 0,1 g se rozpustí v lihu 96% R a zředí se jím na 10 ml.

Porovnávací roztok. 50 mg linalolu R se rozpustí v lihu 96% R a zředí se jím na 10 ml.

Na vrstvu se nanese odděleně po 10 μl každého roztoku a vyvíjí se směsí objemových dílů ethylacetatu R a toluenu R (5 + 95) po dráze 12 cm. Vrstva se usuší na vzduchu, postříká se anisaldehydem RS a suší se 5 min až 10 min při 100 °C až 105 °C. Hlavní skvrna na chromatogramu zkoušeného roztoku odpovídá polohou a zbarvením skvrně na chromatogramu porovnávacího roztoku. Na chromatogramu zkoušeného roztoku mohou být i další méně intenzivní skvrny.

Zkoušky na čistotu

Relativní hustota (2.2.5). 0,865 až 0,878.

Index lomu (2.2.6). 1,463 až 1,472.

Specifická optická otáčivost (2.2.7). +8° až +13°.

Voda v silicích (2.8.5). Vyhovuje požadavkům zkoušky Voda v silicích.

Mastné oleje a zpryskyřičnatělé silice (2.8.7). Vyhovuje požadavkům zkoušky Mastné oleje a zpryskyřičnatělé silice v silicích.

Pach a chuť silic (2.8.8). Vyhovuje požadavkům zkoušky Pach a chuť silic.

Zbytek po odpaření silic (2.8.9). Nejvýše 0,150 g.

Rozpustnost v lihu (2.8.10). Je rozpustná ve třech objemových dílech lihu R 70% (V/V).

Stanovení obsahu

5,0 ml se v kuželové baňce se zábrusem smíchá se 7,5 ml směsi formylační dle Béhala R, intenzivně se protřepe a baňka se ihned vloží do vody s ledem. Po 2 h se baňka vyjme a nechá se stát tři dny při obyčejné teplotě, v temnu. K 50 ml chladné vody R v dělicí nálevce se přidá formylovaná silice a intenzivně se protřepe. Po 2 h stání se vodná vrstva odstraní. Formylovaná silice se protřepává 50 ml vody R, pak 50 ml roztoku hydrogenuhličitanu sodného R (50 g/l) a dvakrát 50 ml vody R; vodná vrstva se vždy odstraní. Formylovaná silice se vysuší síranem sodným bezvodým R a zfiltruje se.

1,500 g formylované silice se smíchá se 3 ml lihu 96% R a 0,1 ml fenolftaleinu RS a po kapkách se přidává hydroxid draselný v lihu 0,5 mol/l VS do trvalého zbarvení. Pak se přidá 35,0 ml hydroxidu draselného v lihu 0,5 mol/l VS a vaří se 90 min pod zpětným chladičem. Po ochlazení se přidá 0,5 ml modři thymolové RS a titruje se kyselinou chlorovodíkovou 0,5 mol/l VS do trvalé změny zbarvení. Provede se slepá zkouška.

Obsah volných i vázaných alkoholů v procentech, vyjádřeno jako linalol (C₁₀H₁₈O), se vypočítá podle vzorce:

v němž značí:

1. a - rozdíl spotřeb hydroxidu draselného v lihu 0,5 mol/l VS ve zkoušce a slepé zkoušce v mililitrech,
2. m - navážku formylované silice v gramech.

Uchovávání

Ve zcela naplněných, vzduchotěsných obalech, chráněna před světlem.

† Corticotropinum

Kortikotropin

Je to látka, která se získává z předního laloku hypofýzy prasete. Obsahuje kortikotropní peptid, který zvyšuje sekreci kortikoidů v nadledvinách. Získaný materiál se zbaví nečistot a vysuší se vhodným způsobem. Účinnost je nejméně 70 m.j. v miligramu.

Výroba

Připravuje se v prostředí, které minimalizuje stupeň mikrobiálního znečištění.

Vlastnosti

Bílý nebo téměř bílý hygroskopický prášek nebo vločky. Jeho roztok (10 g/l) je čirý nebo slabě opalizující.

Zkoušky totožnosti

1. A. Snižuje koncentraci kyseliny askorbové v nadledvinách po podání ve zkoušce Stanovení účinnosti (zkouška A nebo zkouška B).
2. B. Provede se kapalinová chromatografie (2.2.29).

   Zkoušený roztok. 1 mg se rozpustí v 1,0 ml kyseliny chlorovodíkové 0,05 mol/l RS.

   Porovnávací roztok. 1 mg kortikotropinu CRL se rozpustí v 1,0 ml kyseliny chlorovodíkové 0,05 mol/l RS.

   Chromatografický postup se obvykle provádí za použití:

   1. - nerezové ocelové kolony délky 0,25 m a vnitřního průměru 4,6 mm naplněné silikagelem oktadecylsilanizovaným pro chromatografii R (5 m),
   2. - mobilních fází s průtokovou rychlostí 1 ml/min:
   3. - mobilní fáze A roztok dihydrogenfosforečnanu sodného R (15,6 g/l), jehož pH bylo upraveno kyselinou fosforečnou R na 2,0,
   4. - mobilní fáze B - acetonitril R,
   5. - spektrofotometrického detektoru, 280 nm.

   Kolona se uvede do rovnovážného stavu směsí objemových dílů mobilní fáze B a mobilní fáze A (20 + 80) a 5 min se zaznamenává chromatogram. Dále se provede gradientová eluce s lineárně rostoucím podílem mobilní fáze B na 40 objemových dílů o 0,33 % (V/V) za minutu po dobu 60 min. Nakonec se 15 min eluuje směsí objemových dílů mobilní fáze B a mobilní fáze A (20 + 80). Nastříkne se odděleně 100 1 každého roztoku. Retenční čas hlavního píku na chromatogramu zkoušeného roztoku odpovídá retenčnímu času hlavního píku na chromatogramu porovnávacího roztoku. Zkoušku lze hodnotit, jestliže asymetrie hlavního píku na chromatogramu porovnávacího roztoku je 0,8 až 2,0 a jestliže počet teoretických pater vypočtených pro hlavní pík je nejméně 1000.

1. C. Vyhodnotí se elektroforeogramy ze zkoušky Příbuzné bílkoviny. Na elektroforeogramu zkoušeného roztoku se poloha hlavní zóny shoduje s polohou hlavní zóny na elektroforeogramu porovnávacího roztoku (a).

Zkoušky na čistotu

Hodnota pH (2.2.3). 3,0 až 5,0; měří se roztok (10 g/l) ve vodě prosté oxidu uhličitého R.

Nečistoty vyšší molekulové hmotnosti než kortikotropin. Provede se vylučovací chromatografie (2.2.30).

Zkoušený roztok. 1 mg se rozpustí v 1 ml roztoku kyseliny octové R (60 g/l) obsahující dodecylsíran sodný R (10 g/l). Zahřívá se 10 min na 100 °C a nechá se zchladnout.

Chromatografický postup se obvykle provádí za použití:

1. - kolony délky 0,85 m a vnitřního průměru 10 mm naplněné polyakrylamidem nebo dextranem síťovaným pro chromatografii s dělicí schopností pro peptidy o relativní molekulové hmotnosti přibližně 1000 až 10 000,
2. - mobilní fáze: roztok kyseliny octové R (60 g/l) o průtoku 7 ml/h,
3. - spektrofotometrického detektoru, 276 nm, se zapisovačem a s průtokovou kyvetou o objemu nejvýše 1 ml. Detektor a zapisovač se nastaví tak, aby rozsah stupnice zapisovače odpovídal 0,5 jednotky absorbance.

Kolona se uvede do rovnovážného stavu roztokem kyseliny octové R (60 g/l), nastříkne se 0,4 ml zkoušeného roztoku na 1 cm2 plochy průřezu kolony a provede se eluce. Součet ploch všech píků eluovaných před hlavním píkem není větší než 5,0 % součtu ploch všech píků na chromatogramu.

Příbuzné bílkoviny. Provede se elektroforéza na polyakrylamidovém gelu (2.2.31). Použije se sloupec gelu délky 80 mm a průměru 5 mm a tlumivý roztok trometamol-glycinový o pH 8,3. Elektroda v dolní zásobní nádobce tvoří anodu a v horní nádobce katodu.

Příprava gelu. Smíchají se 3 díly vody R, 3 díly roztoku obsahujícího ve 100 ml 28 g akrylamidu R a 0,735 g methylenbisakrylamidu R a 1 díl roztoku obsahujícího ve 100 ml 36,6 g trometamolu R, 0,23 ml tetramethylethylendiaminu R a 48,0 ml kyseliny chlorovodíkové R. Roztok se odplyní a přidá se 1 díl roztoku peroxodisíranu diamonného R (5,6 g/l).

Zkoušený roztok. 1 mg se rozpustí v 1 ml tlumivého roztoku trometamol-glycinového o pH 8,3 a zředí se roztokem sacharosy R (400 g/l) na 2 ml.

Porovnávací roztok (a). 1 mg kortikotropinu CRL se rozpustí v 1 ml tlumivého roztoku trometamol-glycinového o pH 8, 3 a zředí se roztokem sacharosy R (400 g/l) na 2 ml.

Porovnávací roztok (b). 1 ml porovnávacího roztoku (a) se zředí směsí stejných objemových dílů tlumivého roztoku trometamol-glycinového o pH 8,3 a roztoku sacharosy R (400 g/l) na 2 ml.

Porovnávací roztok (c). 1 ml porovnávacího roztoku (b) se zředí směsí stejných objemových dílů tlumivého roztoku trometamol-glycinového o pH 8,3 a roztoku sacharosy R (400 g/l) na 2 ml.

Na povrch gelu se odděleně nanese po 100 μl každého roztoku. Po přidání tlumivého roztoku se přidá 0,2 ml modři bromfenolové RS. Elektroforetický proces probíhá 30 min při konstantním proudu 1 mA na trubičku, dále 100 min při proudu 3 mA na trubičku. Gely se 1 h barví v roztoku černi amido 10 B R (10 g/l) v 7% roztoku (V/V) kyseliny octové R Poté se gely 24 h vymývají v 7% (V/V) roztoku kyseliny octové R. Elektroforeogramy se vyhodnotí pomocí lampy se studeným světelným zdrojem. Na elektroforeogramu zkoušeného roztoku není žádná zóna intenzivnější než zóna se stejnou pohyblivostí, jako má hlavní zóna na elektroforeogramu porovnávacího roztoku (a). Zkoušku lze hodnotit, jestliže elektroforeogram porovnávacího roztoku (c) vykazuje viditelnou zónu; na elektroforeogramech porovnávacích roztoků (a), (b) a (c) je patrna gradace intenzity zbarvení.

Presorický účinek. Nejvýše 5 m.j. presorického účinku na 100 m.j. kortikotropní účinnosti. Účinek zkoušené látky na krevní tlak potkana se porovnává s účinkem mezinárodního standardu lysin-vasopresinu nebo referenčního přípravku lysin-vasopresinu kalibrovaného v mezinárodních jednotkách. Hodnotu účinnosti mezinárodního standardu v mezinárodních jednotkách vyhlašuje Světová zdravotnická organizace.

Ke zkoušce se použije bílý laboratorní potkan, samec o hmotnosti přibližně 300 g. Do ocasní žíly zvířete se vstříkne pomalu roztok vhodného alfa-adrenergního blokátoru v dávce např. 10 ml/kg tělesné hmotnosti. Roztok se připraví rozpuštěním 5 mg fenoxybenzamoniumchloridu R v 0,1 ml lihu 96% R. Přidá se 0,05 ml kyseliny chlorovodíkové 1 mol/l RS a zředí se roztokem chloridu sodného R (9 g/l) na 5 ml. Za 18 h se potkan anestezuje vhodným anestetikem tak, aby nenastalo nepříznivé ovlivnění krevního tlaku. Za 45 min až 60 min se upevní potkan připoutáním zadních končetin v poloze na zádech k operačnímu stolku. Zavede se skleněná nebo polyethylenová kanyla o zevním průměru 2,5 mm do průdušnice a vypreparuje se arteria carotis, aby byla připravena pro zavedení kanyly. V místech tříselného vazu se vypreparuje femorální žíla. K jedné straně se odkloní povrchová stydká žíla a nastříhne se femorální žíla směrem k tříselnému vazu. Z hloubky přicházející přívodní větev femorální žíly se podváže, aby se zabránilo krvácení při zavádění kanyly. Do femorální žíly se zavede krátká polyethylenová kanyla o zevním průměru 1 mm, připevní se dvěma podvazy a připojí se pomocí krátké ohebné hadičky na byretu s obsahem 1 ml s připojenou skleněnou nálevkou s ostrým zakončením. Byreta je naplněna roztokem chloridu sodného R (9 g/l) o teplotě asi 37 °C. Preparované místo a kanyla se zakryjí navlhčenou chirurgickou rouškou, která se připevní. Vstříkne se heparin rozpuštěný v roztoku chloridu sodného R (9 g/l) v dávce 200 m.j./100 g hmotnosti pokusného zvířete. Do arteria carotis se zavede kanyla o zevním průměru 1 mm a naplní se pomocí hadiček roztokem chloridu sodného R (9 g/l) s heparinem a napojí se na vhodný přístroj, který zaznamenává krevní tlak. Centrální a periferní nervový systém, včetně obou vagů a souvisejících sympatických nervů, zůstávají bez porušení. Umělé dýchání není zapotřebí. Všechny roztoky se vstříknou do žilní kanyly pomocí 1ml injekční stříkačky dělené po 0,01 ml. Po každém podání se vstříkne 0,2 ml roztoku chloridu sodného R (9 g/l) z byrety. Dává se pozor, aby nebyl vstříknut vzduch.

Referenční přípravek a zkoušená látka se naředí roztokem chloridu sodného R (9 g/l) tak, aby vstřikovaný objem byl v rozmezí 0,1 ml až 0,5 ml. Zvolí se dvě dávky porovnávacího roztoku tak, aby vzestup krevního tlaku odpovídal 4 kPa pro nižší dávku a 6,67 kPa pro vyšší, ale ne maximální dávku. Poměr nižší k vyšší dávce je určen vzestupem krevního tlaku a je obvykle 3 : 5. Pro počáteční přiblížení se mohou zkusit dávky 3 milijednotky a 5 milijednotek. U referenčního lysin-vasopresinu se provede výpočet geometrického průměru jednotek pro nižší a vyšší dávku. Připraví se taková dávka zkoušeného přípravku, aby v objemu 0,1 ml až 0,5 ml obsahovala dvacetinásobek tohoto průměru v mezinárodních jednotkách kortikotropinu. Dávky se vstřikují v pravidelných intervalech 10 min až 15 min, přičemž dvě dávky porovnávacího roztoku tvoří s dávkou zkoušené látky jednu skupinu o třech dávkách. Pořadí vstřikovaných dávek v následujících skupinách se náhodně střídá, až se vytvoří čtyři až pět skupin (dvanáct až patnáct dávek celkem). U každé dávky se změří maximální zvýšení krevního tlaku.

Průměrná hodnota odpovědi u zkoušené látky je menší než hodnota geometrického průměru obou dávek referenčního přípravku (5 m.j. presorické účinnosti na 100 m.j. účinnosti kortikotropinu).

Ztráta sušením (2.2.32). Nejvýše 7,0 %; stanoví se ve vakuové sušárně při 60 °C a při tlaku nepřekračujícím 670 Pa.

Sterilita (2.6.1). Pokud je látka určena k výrobě parenterálních přípravků bez dalšího vhodného sterilizačního postupu, vyhovuje zkoušce na sterilitu.

Bakteriální endotoxiny (2.6.14). Pokud je látka určena k výrobě parenterálních přípravků bez dalšího postupu odstraňujícího bakteriální endotoxiny, vyhovuje zkoušce na bakteriální endotoxiny, obsahuje-li nejvýše nejvýše 318 m.j. endotoxinu v miligramu.

Stanovení účinnosti

Mezinárodní jednotka kortikotropinu je účinnost obsažená v deklarovaném množství mezinárodního standardu. Hodnotu účinnosti mezinárodního standardu v mezinárodních jednotkách vyhlašuje Světová zdravotnická organizace.

Nalezená hodnota účinnosti je 80 % až 125 % deklarované účinnosti. Interval spolehlivosti (P = 0,95) stanovené účinnosti je v rozmezí 64 % až 156 % deklarované účinnosti.

Stanovení účinnosti se provádí metodou A nebo B.

1. A. Provede se stanovení účinnosti kortikotropinu (2.7.3). Zvířata, u kterých byly provedena hypofyzektomie, mohou být nahrazena zvířaty, u kterých byla endogenní kortikotropní aktivita potlačena vhodnou látkou, např. dexamethasonem podávaným následujícím způsobem: každému zvířeti se vstříknou dvě dávky, každá po 0,5 ml, suspenze obsahující 2 mg dexamethasonu a arabskou klovatinu (50 g/l). První dávka se vstříkne podkožně 18 h před zahájením zkoušky, druhá dávka se vstříkne intraperitoneálně současně se zkoušenou látkou. Mezi oběma parenterálními dávkami dostávají zvířata pitnou vodu s dexamethasonem (20 μg/ml) a glukosou (50 g/l).
2. B. Účinnost kortikotropinu se stanoví za daných podmínek porovnáním zvýšené tvorby kortikosteronu produkovaného izolovanými buňkami nadledvin potkanů s mezinárodním standardem nebo s referenčním přípravkem kalibrovaným v mezinárodních jednotkách.

Použije se silikonované sklo před použitím dobře vymyté vodou R. Šetrným způsobem bez stresu se usmrtí 4 laboratorní potkani, samci o hmotnosti 200 g až 400 g. Vyjmou se nadledviny, opatrně očistí od okolní tukové tkáně a vloží do roztoku B uchovávaného při 4 °C. Každá žláza se rozkrojí na čtyři stejné díly a přenese do vhodného míchacího zařízení z plastické hmoty (viz obrázek 1), ve kterém je 5 ml roztoku C udržovaného při 37 °C. Buňky nadledvin se dispergují mícháním směsi při 500 ot/min. Po 20 min se odstraní supernatant, ochladí na 4 °C, přidá se 5 ml roztoku C a znovu míchá. Tento postup se opakuje ještě třikrát. Všech pět supernatantů se spojí a odstřeďuje 30 min v polyethylenových zkumavkách při 4 °C při postupném zvyšování rychlosti do 100 gn. Sediment se suspenduje v 8 ml roztoku D a odstřeďuje 30 min při 100 g_n. Získaný sediment se znovu suspenduje v 8 ml roztoku D, směs se filtruje přes nylonovou síťku s otvory 100 μm do polyethylenové kádinky a k filtrátu se přidá vhodný objem roztoku D (bylo zjištěno, že vhodný celkový objem filtrátu je mezi 65 ml až 105 ml). Výsledný buněčný roztok se uchovává při 4 °C.

Ze zkoušeného roztoku o vhodné koncentraci a z porovnávacího roztoku se připraví s ředicím roztokem E čtyři koncentrace v geometrické řadě s dvojnásobným ředěním. 0,1 ml z každého zředění se pipetuje do čtyř polystyrénových zkumavek a do každé zkumavky se přidá 1,0 ml výše připravené buněčné suspenze. Zkumavky se inkubují 2 h při 37 °C a pak ochladí na 4 °C. 1 ml obsahu každé zkumavky se přenese do skleněných zkumavek obsahujících 1,4 ml dichlormethanu R, směs se promíchá 10 s na vířivé míchačce a odstřeďuje 5 min při 3000 gn. 1 ml dichlormethanové vrstvy z každé zkumavky se přenese, bez porušení vodné vrstvy, do skleněných zkumavek obsahujících 0,6 ml směsi objemových dílů lihu 96% R a kyseliny sírové R (15 + 35). Směs se 10 s míchá na vířivé míchačce, odstřeďuje 5 min při 1500 g_n a nechá 30 min stát. Fluorimetricky (2.2.21) se stanoví iradiace spodní vrstvy při excitační vlnové délce 436 nm nebo 470 nm a fluorescence se měří v maximu mezi 530 nm a 545 nm. Jestliže roztoky nejsou při měření přeneseny do kyvet, je nutné vybrat zkumavky, v nichž se fluorescenční hodnoty pro standard kortikosteronu neliší mezi sebou více než o 5 %.

Výsledky stanovení se počítají obvyklými statistickými metodami. Použije se lineární část křivky závislosti odpovědi na log dávky.

Roztok B. K roztoku A se přidá glukosa R (2 g/l).

Roztok C. K roztoku B se přidá kolagenasa získaná z Clostridium histolyticum a dostatečně čistá pro přípravu dispergovaných buněk (1 g/l).

Roztok D. K roztoku B se přidá albumin hovězí R (5 g/l).

Roztok E. Ke sterilnímu roztoku chloridu sodného R (9 g/l) se přidá albumin hovězí R (1 g/l) a pH roztoku se upraví kyselinou chlorovodíkovou 1 mol/l RS na 2,0.

Obr. 1.

Rozměry v milimetrech

1. A - kladka a míchací lopatka
2. B - ložisko
3. C - inkubační roztok

Uchovávání

V dobře uzavřeném obalu chráněn před světlem, při teplotě nepřevyšující 25 °C. Je-li látka sterilní, uchovává se ve sterilním vzduchotěsném zabezpečeném obalu.

Separandum.

Označování

V označení na obalu se uvede:

1. - způsob podání při stanovení účinnosti (při použití zkoušky A),
2. - zda je látka sterilní,
3. - zda je látka prostá bakteriálních endotoxinů.

† Cortisoni acetas

Kortisonacetat

Vlastnosti

Bílý nebo téměř bílý krystalický prášek. Je prakticky nerozpustný ve vodě, snadno rozpustný v dichlormethanu, dobře rozpustný v dioxanu, mírně rozpustný v acetonu, těžce rozpustný v lihu 96%, v etheru a v methanolu.

Vykazuje polymorfismus.

Zkoušky totožnosti

Základní sestava zkoušek: A a B.

Alternativní sestava zkoušek: C, D a E, viz Obecné zásady (1.2).

1. A. Infračervené absorpční spektrum (2.2.24) zkoušené látky se shoduje se spektrem kortisonacetatu CRL. Jestliže spektrum zkoušené látky a spektrum referenční látky v tuhém stavu vykazují rozdíly, zaznamenají se spektra látek znovu za použití roztoku zkoušené látky a roztoku referenční látky (50 g/l) v dichlormethanu R v 0,2mm kyvetách.
2. B. Provede se tenkovrstvá chromatografie (2.2.27) za použití vhodného silikagelu s fluorescenčním indikátorem pro detekci při 254 nm.

   Zkoušený roztok. 10 mg se rozpustí ve směsi objemových dílů methanolu R a dichlormethanu R (1 + 9) a zředí se stejnou směsí na 10 ml.

   Porovnávací roztok (a). 20 mg kortisonacetatu CRL se rozpustí ve směsi objemových dílů methanolu R a dichlormethanu R (1 + 9) a zředí se stejnou směsí na 20 ml.

   Porovnávací roztok (b). 10 mg hydrokortisonacetatu R se rozpustí v porovnávacím roztoku (a) a zředí se jím na 10 ml.

   Na vrstvu se odděleně nanese po 5 1 každého roztoku a vyvíjí se směsí připravenou přidáním směsi objemových dílů vody R a methanolu R (1,2 + 8) ke směsi objemových dílů etheru R a dichlormethanu R (15 + 77) po dráze 15 cm. Vrstva se usuší na vzduchu a pozoruje se v ultrafialovém světle při 254 nm. Hlavní skvrna na chromatogramu zkoušeného roztoku se polohou a velikostí shoduje s hlavní skvrnou na chromatogramu porovnávacího roztoku (a). Vrstva se postříká kyselinou sírovou v lihu RS a zahřívá se 10 min nebo do objevení skvrn při 120 °C. Po ochlazení se vrstva pozoruje v denním světle a v ultrafialovém světle při 365 nm. Hlavní skvrna na chromatogramu zkoušeného roztoku se shoduje polohou, barvou v denním světle, fluorescencí v ultrafialovém světle při 365 nm a velikostí s hlavní skvrnou na chromatogramu porovnávacího roztoku (a). Zkoušku lze hodnotit, jestliže na chromatogramu porovnávacího roztoku (b) jsou dvě zřetelně oddělené skvrny.

1. C. Provede se tenkovrstvá chromatografie (2.2.27) za použití vhodného silikagelu s fluorescenčním indikátorem pro detekci při 254 nm.

   Zkoušený roztok (a). 25 mg se rozpustí mírným zahřátím v methanolu R a zředí se jím na 5 ml (tento roztok se použije také k přípravě zkoušeného roztoku (b)). 2 ml tohoto roztoku se zředí dichlormethanem R na 10 ml.

   Zkoušený roztok (b). 2 ml roztoku získaného při přípravě zkoušeného roztoku (a) se přenesou do 15ml skleněné zkumavky se skleněnou nebo polytetrafluoroethylenovou zátkou, přidá se 10 ml hydrogenuhličitanu draselného nasyceného v methanolu RS a ihned se do roztoku zavede proud dusíku R a probublává se intenzivně po dobu 5 min. Pak se zkumavka uzavře a zahřívá se ve vodní lázni při 45 °C chráněna před světlem po dobu 2 h 30 min. Nechá se ochladit.

   Porovnávací roztok (a). 25 mg kortisonacetatu CRL se rozpustí mírným zahřátím v methanolu R a zředí se jím na 5 ml (tento roztok se použije také k přípravě porovnávacího roztoku (b)). 2 ml tohoto roztoku se zředí dichlormethanem R na 10 ml.

   Porovnávací roztok (b). 2 ml roztoku získaného při přípravě porovnávacího roztoku (a) se přenesou do 15ml skleněné zkumavky se skleněnou nebo polytetrafluoroethylenovou zátkou, přidá se 10 ml hydrogenuhličitanu draselného nasyceného v methanolu RS a ihned se do roztoku zavede proud dusíku R a probublává se intenzivně po dobu 5 min. Pak se zkumavka uzavře a zahřívá se ve vodní lázni při 45 °C chráněna před světlem po dobu 2 h 30 min. Nechá se ochladit.

   Na vrstvu se odděleně nanese po 5 μl každého roztoku a vyvíjí se směsí připravenou přidáním směsi objemových dílů vody R a methanolu R (1,2 + 8) do směsi objemových dílů etheru R a dichlormethanu R (15 + 77) po dráze 15 cm. Vrstva se usuší na vzduchu a pozoruje se v ultrafialovém světle při 254 nm. Hlavní skvrna na chromatogramech zkoušených roztoků se polohou a velikostí shoduje s hlavní skvrnou na chromatogramu odpovídajícího porovnávacího roztoku. Vrstva se postříká kyselinou sírovou v lihu RS a zahřívá se 10 min nebo do objevení skvrn při 120 °C. Po ochlazení se vrstva pozoruje v denním světle a v ultrafialovém světle při 365 nm. Hlavní skvrna na chromatogramech zkoušených roztoků se shoduje polohou, barvou v denním světle a fluorescencí v ultrafialovém světle při 365 nm a velikostí s hlavní skvrnou na chromatogramu odpovídajícího porovnávacího roztoku. Hlavní skvrny na chromatogramu zkoušeného roztoku (b) a porovnávacího roztoku (b) mají hodnotu R_F zřetelně nižší než hlavní skvrny na chromatogramu zkoušeného roztoku (a) a porovnávacího roztoku (a).

1. D. Asi 2 mg se přidají ke 2 ml kyseliny sírové R a třepe se do rozpuštění; do 5 min vznikne slabě žluté zbarvení. Roztok se přidá k 10 ml vody R a promíchá se; zbarvení zmizí a zůstane čirý roztok.
2. E. Asi 10 mg vyhovuje zkoušce na acetyl (2.3.1).

Zkoušky na čistotu

Specifická optická otáčivost (2.2.7). + 211 ° až +220°, počítáno na vysušenou látku. Měří se roztok připravený rozpuštěním 0,250 g v dioxanu R a zředěním stejným rozpouštědlem na 25,0 ml.

Příbuzné látky. Stanoví se kapalinovou chromatografií (2.2.29).

Zkoušený roztok. 25,0 mg se rozpustí v mobilní fázi a zředí se jí na 10,0 ml.

Porovnávací roztok (a). 2 mg kortisonacetatu CRL a 2 mg hydrokortisonacetatu R se rozpustí v mobilní fázi a zředí se jí na 100,0 ml.

Porovnávací roztok (b). 1,0 ml zkoušeného roztoku se zředí mobilní fází na 100,0 ml.

Chromatografický postup se obvykle provádí za použití:

1. - nerezové ocelové kolony délky 0,25 m a vnitřního průměru 4,6 mm naplněné silikagelem oktadecylsilanizovaným pro chromatografii R (5 μm),
2. - mobilní fáze, kterou je směs připravená takto: v 1000ml odměrné baňce se smíchá 400 ml acetonitrilu R s 550 ml vody R a nechá se ustálit, směs se doplní na 1000 ml vodou R a znovu se promíchá, průtoková rychlost je 1 ml/min,
3. - spektrofotometrického detektoru, 254 nm.

Kolona se ustálí promýváním mobilní fází po dobu 30 min při průtokové rychlosti 1 ml/min. Nastříkne se 20 μl porovnávacího roztoku (b) a nastaví se citlivost systému tak, aby výška hlavního píku nebyla menší než 50 % rozsahu stupnice zapisovače.

Nastříkne se 20 μl porovnávacího roztoku (a). Je-li chromatogram zaznamenán za popsaných podmínek, retenční časy jsou: hydrokortisonacetatu asi 10 min a kortisonacetatu asi 12 min. Zkoušku lze hodnotit, jestliže rozlišení mezi píky hydrokortisonacetatu a kortisonacetatu není menší než 4,2. Je-li třeba, upraví se koncentrace acetonitrilu v mobilní fázi. Nastříkne se odděleně 20 μl zkoušeného roztoku a 20 μl porovnávacího roztoku (b) a chromatografie se nechá probíhat po dobu odpovídající dvojnásobku retenčního času hlavního píku. Na chromatogramu zkoušeného roztoku plocha žádného píku, kromě hlavního píku, není větší než polovina plochy hlavního píku na chromatogramu porovnávacího roztoku (b) (0,5 %); součet ploch všech píků, kromě hlavního píku, není větší než 1,5násobek plochy hlavního píku na chromatogramu porovnávacího roztoku (b) (1,5 %). Nepřihlíží se k píkům, jejichž plocha je menší než 0,05násobek plochy hlavního píku na chromatogramu porovnávacího roztoku (b).

Ztráta sušením (2.2.32). Nejvýše 0,5 %; 0,500 g se suší v sušárně při 100 °C až 105 °C.

Stanovení obsahu

0,100 g se rozpustí v lihu 96% R a zředí se jím na 100,0 ml. 2,0 ml tohoto roztoku se zředí lihem 96% R na 100,0 ml. Měří se absorbance (2.2.25) v maximu při 237 nm.

Obsah C₂₃H₃₀O₆ se vypočítá za použití specifické absorbance, která má hodnotu 395.

Uchovávání

V dobře uzavřených obalech, chráněn před světlem.

Separandum.

Nečistoty

1. A. hydrokortisonacetat.

Crataegi folium cum flore

List hlohu s květem

Synonymum. Folium crataegi cum flore

Jsou to usušené kvetoucí vrcholky větví, až 7 cm dlouhé, druhu Crataegus monogyna JACQ. emend.LINDMANN nebo druhu Crataegus laevigata (POIR) D.C. (Crataegus oxyacantha L.).

Obsahuje nejméně 0,7 % flavonoidů, počítáno jako hyperosid (C₂₁H₂₀O₁₂; M_r 464,4), vztaženo na vysušenou drogu.

Vlastnosti

Makroskopický a mikroskopický popis, viz Zkoušky totožnosti A a B.

Zkoušky totožnosti

1. A. Úlomky tmavě hnědých, zdřevnatělých větviček o průměru 1 mm, nejvýše však 2,5 mm, nesoucích střídavé, řapíkaté listy, s malými často opadanými palisty a četnými bílými květy uspořádanými ve svazcích. Listy jsou laločnaté až peřenodílné, vroubkovaně zubaté nebo hustě pilovité. C. laevigata - list třílaločný až pětilaločný, tupě až vroubkovaně zubatý; C. monogyna -list peřenoklaný až peřenodílný se třemi až sedmi úkrojky, jemně a hustě pilovitý. Listy na svrchní straně tmavě zelené až hnědavě zelené; na spodní straně světlejší, šedozelené s dobře patrnou žilnatinou, jsou lysé nebo řídce chlupaté. Květy pětičetné, kalich přirostlý k hnědavě zelené češuli, kališní cípy trojúhelníkovité až kopinaté. Korunní lístky žlutavě bílé až nahnědlé, volné, okrouhlé až široce obvejčité, krátce nehetnaté. Tyčinky četné; semeník spodní, z jednoho až tří plodolistů, každý plodolist uzavírá jedno fertilní vajíčko. C. monogyna je jednosemenný, C. laevigata dvousemenný až třísemenný.
2. B. Droga se upráškuje (355). Prášek je žlutozelený. Pozoruje se pod mikroskopem v chloralhydrátu RS. Práškovaná droga je charakteristická těmito znaky: jednobuněčné krycí chlupy, přímé nebo poněkud zakřivené, se ztlustlými stěnami a širokým luminem, na bázi tečkované; úlomky pokožky listů z buněk se stěnami vlnitě zprohýbanými až mnohohrannými, s velkými anomocytickými průduchy (2.8.3), obklopenými čtyřmi až sedmi buňkami; parenchymatické buňky obsahující krystaly šťavelanu vápenatého 10 μm až 20 μm velké; úlomky koruny s pokožkou z buněk okrouhle mnohohranných, ztlustlých, papilózně vychlípených, se zřetelně paprsčitě zvrásněnou kutikulou; úlomky tyčinek, endothecium na okraji pravidelně obloukovitě ztlustlé; úlomky větviček s kolenchymatickým pletivem, cévami a zdřevnatělými sklerenchymatickými vlákny s úzkým humnem; četná okrouhlá až oválně trojhranná pylová zrna o průměru až 45 μm, s hladkou exinou a třemi klíčními póry.
3. C. Provede se tenkovrstvá chromatografie (2.2.27) za použití vrstvy silikagelu G R.

   Zkoušený roztok. 1,0 g práškované drogy (355) se smíchá s 10 ml methanolu R a zahřívá se 5 min ve vodní lázni při 65 °C za častého protřepávání. Po ochlazení se zfiltruje.

   Porovnávací roztok. 1,0 mg kyseliny chlorogenové R, 2,5 mg hyperosidu R a 2,5 mg rutinu R se rozpustí v 10 ml methanolu R