Český lékopis 1997

Na vrstvu se nanese odděleně do pruhů po 10 μl každého roztoku. Vyvíjí se směsí objemových dílů vody R, kyseliny mravenčí bezvodé R a ethylformiatu R(10 + 10 + 80) po dráze 10 cm. Vrstva se suší 10 min při 100 °C až 105 °C. Po ochlazení se postříká chloridem železitým RS2 tak, aby byly patrny modrošedé skvrny (fenolické sloučeniny).

V dolní třetině chromatogramu zkoušeného roztoku je patrna hlavní skvrna odpovídající svojí polohou hlavní skvrně na chromatogramu porovnávacího roztoku (a), v horní části je patrna úzká skvrna odpovídající svojí polohou skvrně na chromatogramu porovnávacího roztoku (b). Ve střední části chromatogramu zkoušeného roztoku mohou být patrné další méně intenzivně zbarvené skvrny.

Zkoušky na čistotu

Cizí příměsi (2.8.2). Nejvýše 7 % stonků a nejvýše 2 % cizích organických příměsí. Stanoví se s 50 g drogy.

Ztráta sušením (2.2.32). Nejvýše 10,0 %; 2,000 g práškované drogy (355) se suší 4 h v sušárně při 100 °C až 105 °C.

Celkový popel (2.4.16). Nejvýše 7,0 %.

Popel nerozpustný v kyselině chlorovodíkové (2.8.1). Nejvýše 2,0 %.

Stanovení obsahu

Zkouška se provádí, pokud možno, za ochrany před světlem.

Pro přípravu roztoků se používá voda prostá oxidu uhličitého R.

0,750 g práškované drogy (180) se v kuželové baňce smíchá se 150 ml vody R. Zahřeje se k varu a zahřívá se dalších 30 min ve vodní lázni. Ochladí se pod tekoucí vodou, směs se převede do odměrné baňky a zředí se vodou R na 250,0 ml. Po usazení částic drogy se roztok zfiltruje filtračním papírem o průměru 12 cm. Prvních 50 ml filtrátu se odstraní.

Veškeré polyfenoly. 5,0 ml filtrátu se zředí vodou R na 25,0 ml. 5,0 ml tohoto filtrátu se smíchá se 2,0 ml kyseliny fosfowolframové RS a uhličitanem sodným RS se zředí na 50,0 ml. Přesně 3 min po přidání posledního roztoku se měří absorbance (2.2.25) v maximu při 715 nm (A ) za použití vody R jako kontrolní tekutiny.

Polyfenoly neadsorbovatelné na kožní prášek. Ke 20,0 ml filtrátu se přidá 0,20 g kožního prášku CRL a intenzivně se protřepává 60 min, pak se zfiltruje. 5,0 ml filtrátu se zředí vodou R na 25,0 ml. 5,0 ml tohoto roztoku se smíchá se 2,0 ml kyseliny fosfowolframové RS a uhličitanem sodným RS se zředí na 50,0 ml. Přesně 3 min po přidání posledního roztoku se měří absorbance (2.2.25) v maximu při 715 nm (A₂) za použití vody R jako kontrolní tekutiny.

Porovnávací roztok. 50,0 mg pyrogallolu R se rozpustí ve vodě R a zředí se jí na 100,0 ml. 5,0 ml tohoto roztoku se zředí vodou R na 100,0 ml. 5,0 ml tohoto roztoku se smíchá se 2,0 ml kyseliny fosfowolframové RS a uhličitanem sodným RS se zředí na 50,0 ml. Přesně 3 min po přidání posledního roztoku a do 15 min po rozpuštění pyrogallolu se měří absorbance (2.2.25) roztoku v maximu při 715 nm (A₃) za použití vody R jako kontrolní tekutiny.

Obsah tříslovin v procentech se vypočítá podle vztahu:

v němž značí:

1. m - navážku drogy v gramech.

Uchovávání

V dobře uzavřených obalech, chráněn před světlem.

Harpagophyti radix

Synonymum. Radix harpagophyti

Je to řezaný usušený hlíznatý sekundární kořen druhu Harpagophytum procumbens DC. Obsahuje nejméně 1,2 % harpagosidu (C₂₄H₃₀O₁₁; M_r 494,5), vztaženo na vysušenou drogu.

Vlastnosti

Droga šedohnědá až tmavohnědá, hořké chuti.

Makroskopický a mikroskopický popis, viz Zkoušky totožnosti A a B.

Zkoušky totožnosti

1. A. Silné plátky vějířovitého nebo okrouhlého tvaru nebo hrubě nalámané kotouče, na povrchu tmavší, podélně brázdité. Na světlejší řezné ploše je patrné tmavé kambium a zřetelně paprsěitě uspořádané dřevní svazky. Centrální cylindr s jemným soustředným vrstvením. Pod lupou jsou na řezu patrna žlutá až hnědočervená zrna.
2. B. Droga se upráškuje (355). Prášek je hnědožlutý. Pozoruje se pod mikroskopem v chloralhydrátu RS. Práškovaná droga je charakteristická těmito znaky: úlomky korku s velkými, žlutohnědými tenkostěnnými buňkami; úlomky korkového parenchymu s velkými tenkostěnnými buňkami občas obsahují červenohnědá zma inkluzí a jednotlivé žluté kapky; úlomky žebříčkovitě ztlustlých cév a cévic provázené dřevním parenchymem centrálního cylindru; v parenchymu malé jehlice nebo krystaly šťavelanu vápenatého. Práškovaná droga může obsahovat pravoúhlé nebo mnohohranné tečkované sklereidy s tmavě červenohnědým obsahem. Parenchym se floroglucinem RS barví zeleně.
3. C. Provede se tenkovrstvá chromatografie (2.2.27) za použití vrstvy vhodného silikagelu.

   Zkoušený roztok. 1,0 g práškované drogy (355) se zahřívá 10 min na vodní lázni při 60 °C s 10 ml methanolu R. Zfiltruje se a filtrát se odpaří za sníženého tlaku a teploty nepřevyšující 40 °C na asi 2 ml.

   Porovnávací roztok. 1 mg harpagosidu R se rozpustí v 1 ml methanolu R.

   Na vrstvu se nanese odděleně do pruhů po 20 μl obou roztoků. Vyvíjí se směsí objemových dílů vody R, methanolu R a ethylacetatu R (8 + 15 + 77) po dráze 10 cm. Vrstva se usuší v proudu horkého vzduchu. Pozoruje se v ultrafialovém světle při 254 nm. Ve střední části chromatogramů zkoušeného i porovnávacího roztoku je patrna skvrna harpagosidu. Na chromatogramu zkoušeného roztoku jsou patrny další zřetelné skvrny, převážně nad skvrnou harpagosidu. Vrstva se postříká roztokem floroglucinu R (10 g/l) v lihu 96% R a pak kyselinou chlorovodíkovou R. Vrstva se suší 5 min až 10 min při 80 °C. Na chromatogramu zkoušeného i porovnávacího roztoku je zelená skvrna harpagosidu. Na chromatogramu zkoušeného roztoku je několik žlutých až hnědých skvrn pod a nad skvrnou odpovídající harpagosidu.

Zkoušky na čistotu

Škrob. Práškovaná droga se pozoruje pod mikroskopem ve vodě R. Přidá se jod RS1; droga se nebarví modře.

Cizí příměsi (2.8.2). Vyhovuje požadavkům zkoušky Cizí příměsi.

Ztráta sušením (2.2.32). Nejvýše 12,0 %; 1,000 g práškované drogy (355) se suší v sušárně při 100 °C až 105 °C.

Celkový popel (2.4.16). Nejvýše 8,0 %.

Stanovení obsahu

Provede se kapalinová chromatografie (2.2.29) za použití methylcinnamatu R jako vnitřního standardu.

Roztok vnitřního standardu. 0,130 g methylcinnamatu R se rozpustí v 50 ml methanolu R a zředí se jím na 100,0 ml.

Zkoušený roztok. 0,500 g práškované drogy (355) se protřepává 1 h s 50 ml methanolu R a pak se zfiltruje. Filtr se zbytkem drogy se převede do baňky na 100 ml, přidá se 50 ml methanolu R, vaří se 1 h pod zpětným chladičem a po ochlazení se zfiltruje. Baňka i filtr se promyjí dvakrát 5 ml methanolu R. Spojené filtráty a promývací tekutiny se odpaří za sníženého tlaku do sucha, při teplotě nepřesahující 40 °C. Zbytek se smíchá třikrát s 5 ml methanolu R, tekutina se zfiltruje do odměrné baňky na 25 ml; filtr se promyje a tekutina se zředí methanolem R na 25,0 ml. K 10,0 ml tohoto roztoku se přidá 1,0 ml roztoku vnitřního standardu a zředí se methanolem R na 25,0 ml. Porovnávací roztok. 0,5 ml porovnávacího roztoku ze Zkoušky totožnosti C se zředí methanolem R na 2,0 ml.

Chromatografický postup se provádí obvykle za použití:

1. - nerezové ocelové kolony délky 0,10 m a vnitřního průměru 4 mm naplněné silikagelem oktadecylsilanizovaným pro chromatografii R (5 μm),
2. - mobilní fáze, kterou je směs stejných objemových dílů methanolu R a vody R, s průtokovou rychlostí 1,5 ml/min,
3. - spektrofotometrického detektoru, 278 nm,
4. - injektorové smyčky, 10 μl.

Nastříkne se zkoušený roztok. Nastaví se citlivost detektoru tak, aby výška píku methylcinnamatu nebyla menší než 50 % celé stupnice zapisovače.

Stanoví se retenční čas harpagosidu za použití 10 μl porovnávacího roztoku za podmínek stejných jako u zkoušeného roztoku.

Obsah harpagosidu v procentech se vypočítá podle vzorce:

v němž značí:

1. m₁ - navážku drogy v gramech,
2. m₂ - navážku methylcinnamatu R ve 100,0 ml roztoku vnitřního standardu,
3. F₁ - plochu píku harpagosidu na chromatogramu zkoušeného roztoku,
4. F₂ - plochu píku methylcinnamatu na chromatogramu zkoušeného roztoku.

Uchovávání

V dobře uzavřených obalech, chráněn před světlem.

Helianthi oleum

Slunečnicový olej

Vlastnosti

Světle žlutá čirá průhledná kapalina. Je velmi těžce rozpustný v lihu 96%, snadno rozpustný v etheru, mísitelný s etherem petrolejovým.

Tuhne při teplotě asi -16 °C.

Zkoušky totožnosti

1. A. Provede se zkouška Totožnost olejů tenkovrstvou chromatografií (2.3.2). Chromatogram zkouše-ného roztoku se shoduje s charakteristickým chromatogramem pro slunečnicový olej.
2. B. Zkouška Cizí oleje, viz Zkoušky na čistotu, je zároveň zkouškou totožnosti.

Zkoušky na čistotu

Relativní hustota (2.2.5). 0,918 až 0,923.

Index lomu (2.2.6). 1,473 až 1,476.

Číslo kyselosti (2.5.1). Nejvýše 1,0; stanoví se s 10,0 g zkoušené látky.

Číslo jodové (2.5.4). 125,0 až 136,0.

Číslo zmýdelnění (2.5.6). 188,0 až 194,0.

Cizí oleje. Provede se zkouška (2.4.22) Cizí oleje v olejích plynovou chromatografií.

Podíl mastných kyselin má toto složení:

1. - kyselina palmitová: 3,0 % až 10,0 %,
2. - kyselina stearová: 1,0 % až 10,0 %,
3. - kyselina olejová (délkou řetezce odpovídá makrogoladipatu 18,3): 62,0 % až 86,0 %,
4. - kyselina linolová (délkou řetězce odpovídá makrogoladipatu 18,9): 60,0 % až 75,0 %.

Steroly. Provede se zkouška Steroly v olejích (2.4.23). Podíl sterolů oleje obsahuje:

1. - kampesterol: 5,0 % až 10,0 %,
2. - stigmasterol: 5,0 % až 10,0 %,
3. - β-sitosterol: 55,0 % až 65,0 %.
4. - delta 5-avenasterol: 2,0 % až 6,0 %,
5. - delta 7-stigmasterol: 12,0 % až 18,0 %,
6. - delta 7-avenasterol: 2,0 % až 6,0 %.

Bělené nebo zkažené oleje. 1 ml se ve zkumavce protřepává 1 min s 1 ml kyseliny chlorovodíkové R, pak se smíchá s 1 ml resorcinolu RS a protřepává se 5 s. Po 5 min stání není vodná vrstva zbarvena intenzivněji (2.2.2) než 1 ml směsi složené z 0,5 ml manganistanu draselného 0,002 mol/l RS a 9,5 ml vody R.

Uchovávání

Ve zcela naplněných, dobře uzavřených obalech, chráněn před světlem.

† Heparina massae molecularis minoris

Nízkomolekulární hepariny

Jsou to soli sulfatovaných glukosaminoglykanů o průměrné molekulové hmotnosti menší než 8000, z nichž nejméně 60 % látky má molekulovou hmotnost menší než 8000. Jejich různá chemická struktura se projevuje na koncových skupinách polysacharidových řetězců, které jsou povahy redukující nebo neredukující.

Počítáno na vysušenou látku, je v miligramu nejméně 70 m.j. účinnosti protifaktoru Xa. Poměr účinnosti protifaktoru Xa k účinnosti protifaktoru Ha podle postupu popsaného ve zkoušce Stanovení účinnosti činí nejméně 1,5.

Výroba

Při výrobě se používají postupy, které omezují na minimum možnost mikrobiální kontaminace.

Získávají se frakcionací nebo depolymerizací heparinu přirozeného původu, který podle svého složení vyhovuje článku Heparinum natricum nebo Heparinum calcicum pro parenterální použití, pokud není zdůvodněno a schváleno jinak. Homogenita jednotlivých šarží pro každý typ nízko-molekulárního heparinu je zajištěna důkazem, např. takovým, že průměrná molekulová hmotnost a procentuální podíl látky v definovaném rozmezí molekulové hmotnosti nižší než 8000 jsou v rozmezí 75 % až 125 % průměrné hodnoty, kterou je typ specifikován. Stejné rozmezí platí též pro hodnotu poměru účinnosti protifaktoru Xa k účinnosti protifaktoru IIa.

Nukleotidy a bílkovinné nečistoty v surovině. Před frakcionací se rozpustí 40 mg surového materiálu v 10 ml vody A. Absorbance (2.2.25) měřená při 260 nm a 280 nm není větší než 0,20, popř. 0,15.

Vlastnosti

Bílý nebo téměř bílý prášek, hygroskopický, snadno rozpustný ve vodě.

Zkoušky totožnosti

1. A. Provede se nukleární magnetická rezonanční spektrometrie (2.2.33) s použitím pulzního (Fourierova transformace) spektrometru, který pro ¹³C měří při 75 MHz.

   Zkoušený roztok. 0,200 g se rozpustí ve směsi 0,2 ml deuteriumoxidu R a 0,8 ml vody R.

   Porovnávací roztok. 0,200 g nízkomolekulárního heparinu CRL vhodné specifikace se rozpustí ve směsi 0,2 ml deuteriumoxidu R a 0,8 ml vody R.

   Spektra se zaznamenávají při 40 °C za použití kyvety o průměru 5 mm. Jako vnitřní standard se použije methanol deuterizovaný R při 6 = 50,0 ppm.

   Spektrum zkoušeného roztoku se shoduje se spektrem porovnávacího roztoku obsahujícího nízkomolekulární heparin CRL vhodné specifikace.

1. B. Poměr účinnosti protifaktoru Xa k účinnosti protifaktoru IIa stanovený podle postupu popsaného ve Stanovení účinnosti je nejméně 1,5.
2. C. Provede se vylučovací chromatografie (2.2.30).

   Zkoušený roztok. 20 mg se rozpustí ve 2 ml mobilní fáze.

   Porovnávací roztok. 20 mg nízkomolekulárního heparinu pro kalibraci CRL se rozpustí ve 2 ml mobilní fáze.

   Chromatografický postup se obvykle provádí za použití:

   1. - kolony délky 0,30 m a vnitřního průměru 7,5 mm naplněné porézními křemennými kuličkami (5 μm), která má nejméně 20 000 teoretických pater na metr a schopnost frakcionace bílkovin v rozmezí přibližně 15 000 až 100 000,
   2. - mobilní fáze, kterou je roztok síranu sodného R (28,4 g/l), jehož pH bylo upraveno kyselinou sírovou zředěnou RS na 5,0, o průtokové rychlosti 0,5 ml/min,
   3. - detektoru, kterým je diferenční refraktometr.

   Kalibrace systému. Nastříkne se 25 μl porovnávacího roztoku. Detekce se provádí diferenčním refraktometrem (RI) spojeným do série s UV spektrofotometrem nastaveným na vlnovou délku 234 nm. UV monitor je připojen k výstupu z kolony a diferenční refraktometr k výstupu z UV monitoru.

   Je potřebné změřit přesně časový posun mezi oběma detektory, aby se mohly zaznamenané chromatogramy správně přiřadit. Pro kalibraci se použijí retenční časy získané RI detektorem.

   Normalizační faktor, používaný pro výpočet molekulové hmotnosti z poměru RI/UV, se získá takto: vypočítá se celková plocha pod křivkami UV ₂₃₄(ΣUV₂₃₄) a RI (ΣRI) v požadovaném rozsahu (tj. bez píků soli a rozpouštědla na konci chromatogramu). Vypočítá se poměr r:

   Vypočítá se faktor f který násobením hodnotou r dává Mna(známou průměrnou molekulovou hmotnost kalibrační látky). Hodnota M_na kalibrační látky je uvedena v přiloženém certifikátu:

   Jestliže jsou křivky UV₂₃₄a RI správně přiřazeny, je možno molekulovou hmotnost v kterém-koliv bodě vypočítat podle vztahu:

   Nastříkne se 25 μl zkoušeného roztoku a zaznamenávají se chromatogramy po dobu, která zaručuje úplnou eluci píků zkoušené látky i rozpouštědla.

   Průměrná molekulová hmotnost látky je vyjádřena vztahem:

   v němž značí:

   1. RI_i - množství látky (hmoty) eluované ve frakci i,
   2. M_i - molekulovou hmotnost odpovídající frakci i.

   Hodnota průměrné molekulové hmotnosti látky není větší než 8000 a nejméně 60 % celkové látky má molekulovou hmotnost menší než 8000, kromě toho se parametry molekulové hmotnosti zkoušené látky a odpovídající referenční látky neliší více než o 25 %.

1. D. Vyhovuje zkoušce (a) na sodík nebo vápník (2.3.1), podle výchozí látky.

Zkoušky na čistotu

Hodnota pH (2.2.3). 5,5 až 8,0; měří se roztok připravený rozpuštěním 0,1 g ve vodě prosté oxidu uhličitého R a zředěním stejným rozpouštědlem na 10 ml.

Dusík (2.5.9). 1,5 % až 2,5 %, počítáno na vysušenou látku.

Těžké kovy (2.8.4). 0,5 g vyhovuje limitní zkoušce C na těžké kovy (30 μg/g). K přípravě porovnávacího roztoku se použije 1,5 ml základního roztoku olova (10 μg Pb/ml).

Vápník. Je-li připraven z heparinu, který vyhovuje článku Heparinum calcicum, obsahuje 9,5 % až 11,5 % Ca, počítáno na vysušenou látku. Vápník se stanoví chelatometrickou titrací (2.5.11) s 0,200 g zkoušené látky.

Sodík. Je-li připraven z heparinu, který vyhovuje článku Heparinum natricum, obsahuje 9,5 % až 12,5 % Na, počítáno na vysušenou látku. Sodík se stanoví atomovou absorpční spektrometrií (2.2.23, Metoda I).

Zkoušený roztok. 50 mg se rozpustí v kyselině chlorovodíkové 0,1 mol/l RS, která v mililitru obsahuje 1,27 mg chloridu cesného R. Roztok se stejným rozpouštědlem zředí na 100,0 ml.

Porovnávací roztoky. Připraví se porovnávací roztoky o koncentraci 25 μg Na/ml, 50 μg Na/ml a 75 μg Na/ml. K jejich přípravě se použije základní roztok sodíku (200 μg Na/ml), který se zředí kyselinou chlorovodíkovou 0,1 mol/l RS obsahující v mililitru 1,27 mg chloridu cesného R.

Měří se absorbance při 330,3 nm za použití sodíkové lampy s dutou katodou jako zdroje záření a plamene vhodného složení (např. 11 litrů vzduchu a 2 litry acetylenu za minutu).

Ztráta sušením (2.2.32). Nejvýše 10,0 %; 1,000 g se 3 h suší při 60 °C nad oxidem fosforečným R při tlaku nepřesahujícím 670 Pa.

Molární poměr sulfátových a karboxylatových skupin iontů. Nejméně 1,8. Stanoví se titraci za vodivostní indikace (2.2.38). Vzorek zkoušené látky použitý při této titraci neobsahuje ionizovatelné nečistoty, především soli.

0,100 g se naváží do malé kuželové baňky, přičemž se dbá na to, aby se předešlo problémům spojeným s hygroskopickými vlastnostmi látky. Přidá se 20 ml vody R, dvakrát destilované ve skle a ochladí na 4 °C. 2,0 ml tohoto roztoku se nanesou na předchlazenou kolonu (asi 10 cm x 1 cm) naplněnou vhodným katexem R. Kolona se promývá dvakrát ve skle vodou destilovanou R, která se zachycuje v titrační nádobě do konečného množství 10 ml až 15 ml. (Titrační nádoba musí být dostatečně velká, aby se do ní umístily elektrody z konduktometru, míchací tělísko a jemná ohebná trubička z vývodu 2ml byrety). Míchání je magnetické. Až jsou údaje na konduktometru konstantní, zaznamenají se a začne se titrovat hydroxidem sodným 0,05 mol/l VS, který se přidává v 50 μl dávkách. Vždy po přidání se za několik sekund zaznamenají údaje na byretě a na konduktometru. Titruje se do dosažení konečného bodu.

Pro každou naměřenou hodnotu se vypočítá množství miliekvivalentů přidaného hydroxidu sodného z objemu a známé koncentrace roztoku hydroxidu sodného. Do grafu se nanesou hodnoty vodivosti (na osu y) proti hodnotám miliekvivalentů hydroxidu sodného (na ose x). Graf má tři přibližně lineární části: počáteční klesající stupeň křivky, střední mírně vzrůstající a konečný prudce vzrůstající stupeň křivky. Těmito třemi částmi grafu se proloží nejvhodnější přímky. Z bodů, v nichž se protne první přímka s druhou a druhá přímka s třetí, se spustí kolmice k ose x, na níž se odečtou miliekvivalenty hydroxidu sodného spotřebovaného při titraci vzorku v daných bodech. Bod, v němž se protnou první a druhá přímka, udává množství miliekvivalentů hydroxidu sodného spotřebovaného sulfátovými skupinami a bod, v němž se protnou druhá a třetí přímka, udává množství miliekvivalentů spotřebovaných společně sulfatovými i karboxylatovými skupinami. Rozdíl mezi těmito dvěma hodnotami udává množství miliekvivalentů spotřebovaných karboxylatovými skupinami.

Sterilita (2.6.1). Pokud je látka určena k výrobě parenterálních přípravků bez dalšího vhodného sterilizačního postupu, vyhovuje zkoušce na sterilitu.

Bakteriální endotoxiny (2.6.14). Pokud je látka určena k výrobě parenterálních přípravků bez dalšího vhodného postupu odstraňujícího bakteriální endotoxiny, vyhovuje zkoušce na bakteriální endotoxiny, obsahuje-li nejvýše 0,01 m.j. endotoxinu v mezinárodní jednotce účinnosti protifaktoru Xa. Pro splnění validačních požadavků může být nezbytné přidání dvojmocných kationtů.

Stanovení účinnosti

Antikoagulační účinnost nízkomolekulárního heparinu se určí in vitro dvěma metodami, které stanoví jeho schopnost urychlovat inhibici faktoru Xa (anti-Xa zkouška) a trombinu, faktoru Ha (anti-IIa zkouška) antitrombinem III.

Mezinárodními jednotkami jsou účinnosti protifaktoru Xa a protifaktoru Ha obsažené v deklarovaném množství mezinárodního standardu nízkomolekulárního heparinu.

Nízkomolekulární heparin pro stanovení účinnosti BRP je kalibrován v mezinárodních jednotkách na mezinárodní standard dvěma dále uvedenými metodami.

Účinnost protifaktoru Xa

Porovnávací a zkoušené roztoky. Připraví se čtyři nezávislé série se čtyřmi koncentracemi pro každou zkoušenou látku a referenční přípravek nízkomolekulárního heparinu v tlumivém roztoku trometamolovém o pH 7,4. Rozmezí koncentrací je 0,025 m.j. až 0,2 m.j. účinnosti protifaktoru Xa v mililitru. Závislost mezi hodnotami absorbance a logaritmy koncentrací má být lineární.

Postup. Připraví se šestnáct zkumavek, které se vždy po dvou označí písmeny T₁, T₂, T₃ a T₄ pro ředění zkoušené látky a písmeny S₁, S₂, S₃ a S₄ pro ředění referenčního přípravku. Do každé zkumavky se převede 50 μl antitrombinu IIIRS1 a 50 μl roztoku příslušného ředění zkoušené látky nebo referenčního přípravku. Pokaždé se roztok promíchá tak, aby nevznikly bubliny. Ve vodní lázni nebo v tepelném bloku se uspořádají zkumavky v pořadí S_1, S₂, S₃, S₄, T₁, T₂, T₃, T₄, T₁, T₂, T₃, T₄, S₁, S₂, S₃, S₄ a a ponechají se 1 min při 37 °C. Pak se do každé přidá 100 μl hovězího faktoru Xa RS. Přesně za 1 min inkubace se přidá 250 μl chromoforového substrátu Rl. Reakce se zastaví přesně za 4 min přidáním 375 μl kyseliny octové R. Obsah každé zkumavky se přenese do semimikrokyvety a změří se absorbance (2.2.25) při 405 nm s použitím vhodného zapisovače. Slepé stanovení amidolytické účinnosti se provede na začátku a na konci měření stejným postupem, pouze místo zkoušeného a porovnávacího roztoku se přidá tlumivý roztok trometamolový o pH 7,4. Naměřené hodnoty obou slepých zkoušek se významně neliší. Provede se regresní analýza závislosti absorbance na logaritmech koncentrací zkoušené látky a referenčního přípravku nízkomolekulárního heparinu a vypočítá se účinnost zkoušené látky v mezinárodních jednotkách účinnosti protifaktoru Xa v mililitru pomocí obvyklých statistických metod pro model rovnoběžnosti.

Účinnost protifaktoru IIa

Porovnávací a zkoušené roztoky. Připraví se čtyři nezávislé série se čtyřmi koncentracemi pro každou zkoušenou látku a referenční přípravek nízkomolekulárního heparinu v tlumivém roztoku trometamolovém o pH 7,4. Rozmezí koncentrací je 0,015 m.j. až 0,075 m.j. účinnosti protifaktoru Ila v mililitru. Závislost mezi absorbancí a logaritmy koncentrací má být lineární.

Postup. Připraví se šestnáct zkumavek, které se vždy po dvou označí písmeny T₁, T₂, T₃ a T₄ pro ředění zkoušené látky a písmeny Sl5 S2,S3 a § pro ředění porovnávacího přípravku. Do každé zkumavky se převede 50 μl antitrombinu IIIRS2 a 50 μl roztoku příslušné koncentrace zkoušené látky nebo referenčního přípravku. Pokaždé se roztok promíchá tak, aby nevznikly bubliny. V e vodní lázni nebo v tepelném bloku se zkumavky uspořádají v pořadí S₁, S₂, S₃, S₄, T₁, T₂, T₃, T₄ , T₁, T₂, T₃, T₄, S₁, S₂, S₃, S₄ a ponechají se 1 min při 37 °C. Pak se do každé přidá 100 /d trombinu lidského RS. Přesně za 1 min se přidá 250 μl chromoforového substrátu R2. Reakce se zastaví přes-ně za 4 min přidáním 375 μl kyseliny octové R. Obsah každé zkumavky se přenese do semimikrokyvety a změří se absorbance (2.2.25) při 405 nm s použitím vhodného zapisovače. Slepé stanovení amidolytické účinnosti se provede na začátku a na konci měření stejným způsobem, pouze místo zkoušeného a porovnávacího roztoku se přidá tlumivý roztok trometamolový o pH 7,4. Naměřené hodnoty obou slepých zkoušek se významně neliší. Provede se regresní analýza závislosti absorbance na logaritmech koncentrací zkoušené a referenční látky nízkomolekulárního heparinu a vypočítá se účinnost zkoušené látky v mezinárodních jednotkách účinnosti protifaktoru Ila v mililitru pomocí obvyklých statistických metod pro model rovnoběžnosti.

Uchovávání

Ve vzduchotěsných obalech. Je-li látka sterilní, uchovává se ve sterilních vzduchotěsných zabezpečených obalech.

Separandum.

Označování

V označení na obalu se uvede:

1. - počet mezinárodních jednotek účinnosti protifaktoru Xa v miligramu,
2. - počet mezinárodních jednotek účinnosti protifaktoru IIa v miligramu,
3. - typ nízkomolekulárního heparinu charakterizovaný průměrnou molekulovou hmotností a procenty molekul, které nevybočují z definovaného rozmezí molekulových hmotností,
4. - zdaje látka sterilní,
5. - zdaje látka prostá bakteriálních endotoxinů,
6. - zda látka obsahuje sodnou sůl,
7. - zda látka obsahuje vápenatou sůl.

†† Heparinum calcicum

Vápenatá sůl heparinu

Výroba

Připravuje se z plic hovězího dobytka nebo ze střevních sliznic hovězího dobytka, prasat nebo ovcí. Při výrobě se používají postupy omezující nebo vylučující mikrobiální kontaminaci a pří-tomnost látek snižujících krevní tlak.

Vlastnosti

Bílý nebo téměř bílý prášek. Je mírně hygroskopická, snadno rozpustná ve vodě.

Zkoušky totožnosti

1. A. Zpomaluje srážení čerstvě odebrané krve.
2. B. 0,40 g se rozpustí ve vodě R a zředí se jí na 10,0 ml. Specifická optická otáčivost (2.2.7) tohoto roztoku je nejméně +35°.
3. C. Provede se zónová elektroforéza (2.2.31) za použití agarosy pro elektroforézu R jako nosiče. K ustálení agarosy a jako roztok elektrolytu se použije směs 50 ml kyseliny octové ledové R a 800 ml vody R upravená přidáním hydroxidu lithného R na pH 3 a zředěná vodou R na 1000,0 ml.

   Zkoušený roztok. 25 mg se rozpustí ve vodě R a zředí se jí na 10 ml.

   Porovnávací roztok. Ve stejném objemu vody R se rozpustí sodná sůl heparinu BRP.

   Na proužek se nanese odděleně po 2 μl až 3 μl každého roztoku. Vyvíjí se 10 min proudem 1 mA až 2 mA na centimetr šířky proužku při napětí 300 V. Proužky se barví roztokem modři toluidinové R (1 g/l), jejíž nadbytek se vymyje. Poměr pohyblivostí základní zóny nebo zón na elektroforetogramech zkoušeného roztoku a porovnávacího roztoku je 0,9 až 1,1.

1. D. Vyhovuje zkoušce na vápník (2.3.1).

Zkoušky na čistotu

Vzhled roztoku. Množství zkoušené látky odpovídající 50 000 m.j. se rozpustí ve vodě R a zředí se jí na 10 ml. Roztok je čirý (2.2.1) a není zbarven intenzivněji než stupeň 5 porovnávacího barevného roztoku nejvhodnější barvy (2.2.2, Metoda II).

Hodnota pH (2.2.3). 5,5 až 8,0; měří se roztok připravený rozpuštěním 0,1 g ve vodě prosté oxidu uhličitého R a zředěním stejným rozpouštědlem na 10 ml.

Bílkoviny a nukleotidické nečistoty. 40 mg se rozpustí v 10 ml vody R. Absorbance (2.2.25) měřená při 260 nm není vyšší než 0,20 a absorbance měřená při 280 nm není vyšší než 0,15.

Dusík. Nejvýše 2,5 %, počítáno na vysušenou látku. Dusík se stanoví mineralizací kyselinou sírovou (2.5.9) za použití 0,100 g zkoušené látky.

Vápník. 9,5 % až 11,5 %, počítáno na vysušenou látku. Vápník se stanoví chelatometrickou titrací (2.5.11) za použití 0,200 g zkoušené látky.

Těžké kovy (2.4.8). 0,5 g vyhovuje limitní zkoušce C na těžké kovy (30 μg/g). K přípravě porovnávacího roztoku se použije 1,5 ml základního roztoku olova (10 μg Pb/ml).

Ztráta sušením (2.2.32). Nejvýše 8,0 %. 1,000 g se 3 h suší při 60 °C nad oxidem fosforečným R při tlaku nepřekračujícím 670 Pa.

Síranový popel (2.4.14). 32 % až 40 %, počítáno na vysušenou látku; stanoví se s 0,20 g zkoušené látky.

Sterilita (2.6.1). Pokud je látka určena k výrobě parenterálních přípravků bez dalšího vhodného sterilizačního postupu, vyhovuje zkoušce na sterilitu.

Bakteriální endotoxiny (2.6.14). Pokud je látka určena k výrobě parenterálních přípravků bez dalšího vhodného postupu odstraňujícího bakteriální endotoxiny, vyhovuje zkoušce na bakteriální endotoxiny, obsahuje-li nejvýše 0,01 m.j. endotoxinu v mezinárodní jednotce heparinové účinnosti. Pro splnění validačních požadavků může být nezbytné přidání dvojmocných kationtů.

Stanovení účinnosti

Provede se stanovení heparinu (2.7.5). Zjištěná účinnost je v rozmezí 90 % až 111 % deklarované účinnosti. Interval spolehlivosti stanovené účinnosti (P = 0,95) je v rozmezí 80 % až 125 % deklarované účinnosti.

Uchovávání

Ve vzduchotěsných obalech. Je-li látka sterilní, uchovává se ve sterilních vzduchotěsných zabezpečených obalech.

Venenum.

Označování

V označení na obalu se uvede:

1. - počet mezinárodnách jednotek v miligramu,
2. - název a množství všech přidaných látek,
3. - zdaje látka sterilní,
4. - zdaje látka prostá bakteriálních endotoxinů.

†† Heparinum natricum

Sodná sůl heparinu

Synonymum. Heparinum solubile

CAS 9041-08-1

Je to sodná sůl sulfatovaného glykosaminoglykanu, který je obsažen v tkáních savců. Při úplné hydrolýze se uvolní D-glukosamin, kyselina D-glukuronová, kyselina L-iduronová, kyselina octová a kyselina sírová. Charakteristickou vlastností látky je zpomalení srážení čerstvé krve.

Počítáno na vysušenou látku, je účinnost sodné soli heparinu pro parenterální použití nejméně 150 m.j. v miligramu.

Počítáno na vysušenou látku, je účinnost sodné soli heparinu, která není určena pro parenterální použití, nejméně 120 m.j. v miligramu.

Výroba